秦 偉，楊宇琦，陳一兵，翟 楠，王雪菁，王 煒，劉春蘭，張 月，李 懿，曾東興，劉 丹

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東 中山528400)

通竅活血中藥復(fù)方對(duì)體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下細(xì)胞活力的影響

秦 偉，楊宇琦，陳一兵，翟 楠，王雪菁，王 煒，劉春蘭，張 月，李 懿，曾東興，劉 丹

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬中山醫(yī)院，廣東 中山528400)

目的 觀察通竅活血中藥復(fù)方對(duì)體外缺氧條件下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活力的影響。方法采用SD大鼠制備通竅活血中藥含藥血清和空白血清，以終濃度為0.5 mmol/L的連二亞硫酸鈉作為低缺氧組條件，以終濃度1 mmol/L的連二亞硫酸鈉作為高缺氧組條件，將體外純化培養(yǎng)的大鼠P2代視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞分為6組，分別置于加入空白血清(正常對(duì)照組)、中藥含藥血清(正常中藥干預(yù)組)、空白血清+低連二亞硫酸鈉(低缺氧組)、空白血清+高連二亞硫酸鈉(高缺氧組)、中藥含藥血清+低連二亞硫酸鈉(低缺氧中藥干預(yù)組)、中藥含藥血清+高連二亞硫酸鈉(高缺氧中藥干預(yù)組)的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后比較各組乳酸脫氫酶(LDH)漏出量。結(jié)果低、高缺氧組較正常對(duì)照組LDH值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。正常中藥干預(yù)組LDH數(shù)值與正常對(duì)照組接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。低、高缺氧中藥干預(yù)組LDH漏出量均較對(duì)應(yīng)的缺氧組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論缺氧條件可導(dǎo)致體外純化培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，通透性增加，細(xì)胞活力降低，通竅活血中藥含藥血清可提高缺氧條件下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活力，這可能是通竅活血中藥復(fù)方對(duì)青光眼患者視神經(jīng)保護(hù)的藥物作用途徑之一。

通竅活血;Müller細(xì)胞;缺氧;乳酸脫氫酶

青光眼是世界第二位致盲性眼病，是一組威脅和損害視神經(jīng)視覺(jué)功能的臨床癥候群或眼病，主要與病理性眼壓升高有關(guān)［1，2］。在我國(guó)，隨著醫(yī)療知識(shí)的普及，青光眼診療水平的不斷提高，青光眼患病率日益升高，給社會(huì)、家庭帶來(lái)的生活經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)難以估計(jì)。因此積極探索與研究如何防治青光眼患者視功能損害已成為眼科界研究的一個(gè)主要熱點(diǎn)。機(jī)械學(xué)說(shuō)和血流學(xué)說(shuō)是青光眼視神經(jīng)損害的兩個(gè)傳統(tǒng)學(xué)說(shuō)。其中血流學(xué)說(shuō)認(rèn)為:除去高眼壓之外視神經(jīng)的持續(xù)缺血缺氧是導(dǎo)致青光眼患者視神經(jīng)損害的另一重要因素。目前對(duì)高眼壓條件下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損害的研究較為廣泛、深入，而對(duì)在缺氧條件下視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損害以及其與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損害之間的關(guān)系的研究較少。視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中一種最主要及最重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，自外界膜縱向向內(nèi)伸展，貫穿視網(wǎng)膜全層，包裹并串聯(lián)起視網(wǎng)膜的各類(lèi)神經(jīng)細(xì)胞，對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)支持作用，同時(shí)對(duì)維持視網(wǎng)膜穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境將起到至關(guān)重要的作用［3］。故而本實(shí)驗(yàn)旨在研究缺氧條件下通竅活血中藥復(fù)方對(duì)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活力的影響，已期開(kāi)拓青光眼視神經(jīng)保護(hù)的新方法新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞體外培養(yǎng)用清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠10只，新生7天，雌雄不限。制備通竅活血中藥復(fù)方含藥血清用:清潔級(jí)SD大鼠50只，體質(zhì)量150～180 g，8～12周齡，雌雄各半。兩組動(dòng)物由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第99-11號(hào))。

1.1.2 藥物及試劑 通竅活血中藥復(fù)方(石菖蒲15 g、川芎 10 g、當(dāng)歸 10 g、丹參 10 g、郁金 10 g、桔梗5 g)由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供;連二亞硫酸鈉(天津?yàn)I?？频嫌邢薰?;谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)鑒定 I抗兔多克隆抗體(santa cruz，美國(guó))，II抗生物素化羊克兔抗體(santa cruz，美國(guó));乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase，LDH)檢測(cè)試劑(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中藥含藥血清制備［3～5］50只 SD大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分組分為通竅活血中藥復(fù)方血清組(中藥含藥血清組)、空白對(duì)照組(空白血清組)兩組，每組25只。中藥含藥血清組連續(xù)7天給予通竅活血中藥復(fù)方浸膏，每日灌胃1次，每次10.87 g/kg;空白血清組給予等容量的生理鹽水。末次給藥后1小時(shí)，0.1%戊巴比妥1 ml腹膜下注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血于15 ml離心管，4℃冰箱靜置，24小時(shí)，離心血清(3000 r/min)，56℃水浴箱，滅活后過(guò)濾除菌，分裝于5 ml分裝瓶，－20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞原代及傳代培養(yǎng)及鑒定酶消化法體外純化傳代培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，GS免疫組化染色鑒定，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞取用P2代細(xì)胞。具體方法同前期研究［4～6］

1.2.3 缺氧模型制備 以終濃度為0.5 mmol/L的連二亞硫酸鈉作為低缺氧組條件，以終濃度1 mmol/L的連二亞硫酸鈉作為高缺氧組條件，具體方法同前期研究［5，6］。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 將體外純化培養(yǎng)的大鼠P2代視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞分為6組。正常對(duì)照組:DMEM培養(yǎng)基，含20%空白血清;正常中藥干預(yù)組:DMEM培養(yǎng)基，含20%中藥含藥血清;低缺氧組:DMEM培養(yǎng)基，含20%空白血清、終濃度為0.5 mmol/L的連二亞硫酸鈉;低缺氧中藥干預(yù)組:DMEM培養(yǎng)基，含20%中藥血清、終濃度為0.5 mmol/L的連二亞硫酸鈉;高缺氧組:DMEM培養(yǎng)基，含20%空白血清、終濃度為1 mmol/L的連二亞硫酸鈉;高缺氧中藥干預(yù)組:DMEM培養(yǎng)基，含20%中藥血清、終濃度為1 mmol/L的連二亞硫酸鈉。

1.2.5 視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞LDH漏出量的測(cè)定 將密度為2×106/ml的P2代Müller細(xì)胞接種于48孔培養(yǎng)板，每孔400 μl;培養(yǎng)24 h，棄用含有血清的培養(yǎng)液，加入無(wú)血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，棄用無(wú)血清培養(yǎng)液，加入上述分組不同條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)干預(yù)48 h;每孔收集培養(yǎng)基上清液50 μl，并快速加入LDH檢測(cè)試劑(參照LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)，使用490型酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度D(440nm)的變化，計(jì)算LDH值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞鑒定結(jié)果純化培養(yǎng)原代視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，革蘭氏(GS)染色陽(yáng)性率大于80%，表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)、細(xì)胞核見(jiàn)大量棕色陽(yáng)性反應(yīng)，稍淺的免疫陽(yáng)性反應(yīng)位于細(xì)胞周?chē)?，?xì)胞輪廓表現(xiàn)為蹼形爪以及帶有終足的扁平輪廓，純化的P1代與P2代細(xì)胞GS染色陽(yáng)性率達(dá)85%以上。見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 SD大鼠原代視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞培養(yǎng)5 d后倒置顯微鏡像(×100)

圖2 SD大鼠P2代視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞培養(yǎng)5d后谷氨酰胺合成酶(GS)染色像(×200)

2.2 各組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞LDH漏出量比較低、高缺氧組較正常對(duì)照組LDH值明顯升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。正常中藥干預(yù)組LDH數(shù)值與正常對(duì)照組接近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。低、高缺氧中藥干預(yù)組LDH漏出量均較對(duì)應(yīng)的缺氧組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞LDH漏出量比較 (U/L)

3 討論

早在《龍樹(shù)菩薩眼論》、《秘傳眼科龍木論》《太平圣惠方》等祖國(guó)醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)醫(yī)集中就有對(duì)青光眼的相關(guān)記載，青光眼屬祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中五風(fēng)內(nèi)障(綠風(fēng)、青風(fēng)、黃風(fēng)、烏風(fēng)、黑風(fēng))范疇。青光眼病位在瞳神及目系，多因五志過(guò)極，肝郁氣結(jié)，肝失條達(dá)，氣血淤滯，脈絡(luò)不暢;或年老體弱，氣血不足，氣虛血瘀，玄府閉塞，目竅失養(yǎng)，神光難以發(fā)越，而致神經(jīng)損害從而引起視力下降、視野缺損的相關(guān)病理表現(xiàn)。故青光眼的基本病機(jī)為氣滯血瘀、氣虛血瘀、玄府閉塞;治療法則為益氣活血、通竅明目、開(kāi)啟玄腑實(shí)。本研究選用石菖蒲、當(dāng)歸、川芎、郁金、丹參、桔梗組方:石菖蒲寧神益志、開(kāi)竅醒神;當(dāng)歸補(bǔ)血活血，川芎行氣活血為“血中之氣藥”，郁金涼血活血，行氣開(kāi)郁，丹參活血祛瘀，除煩安神，幾藥同用補(bǔ)血不滯，行血不破，補(bǔ)中有散，散中有收，佐助石菖蒲共濟(jì)通竅活血之功，更佐桔梗寬胸行氣，載藥上行，開(kāi)竅醒神，直達(dá)病位。

Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，它起至自外界膜，縱向伸展，貫穿整個(gè)視網(wǎng)膜直至內(nèi)界膜，其胞體位于內(nèi)核層，其突起與各種神經(jīng)元細(xì)胞密切接觸，并且參與形成視網(wǎng)膜內(nèi)毛細(xì)血管的基底膜。Müller細(xì)胞及其突起沿著視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞分布，這種特征性排列就決定了Müller細(xì)胞將會(huì)更易于調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)在細(xì)胞外的分布。Müller細(xì)胞除了起到視網(wǎng)膜支架及填充等被動(dòng)作用外，還在視網(wǎng)膜微環(huán)境的調(diào)節(jié)中起到重要作用，與神經(jīng)元有雙向信號(hào)傳遞，并且可以表達(dá)各種電壓門(mén)控型離子通道。這些都決定了在視網(wǎng)膜各種生理和病理過(guò)程中Müller細(xì)胞發(fā)揮著重要作用［7］。

細(xì)胞膜具有通透性，其通過(guò)選擇性的控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞膜而控制細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換，從而使細(xì)胞處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境中。細(xì)胞代謝障礙，首要表現(xiàn)就是細(xì)胞膜的通透性發(fā)生障礙。乳酸脫氫酶(LDH)是一種活細(xì)胞內(nèi)的特異性標(biāo)志酶，正常狀態(tài)下細(xì)胞外漏出量極少，病理狀態(tài)下導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性發(fā)生障礙，細(xì)胞外的LDH漏出量則顯著增多，且細(xì)胞受損數(shù)量與LDH累計(jì)漏出量呈正相關(guān)［8］?？梢?jiàn)，病理狀態(tài)下細(xì)胞外LDH漏出量越多，則細(xì)胞膜越不穩(wěn)定。因此，LDH細(xì)胞外釋放量就可作為一個(gè)反映視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞功能受損情況的敏感指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:低缺氧、高缺氧組較正常對(duì)照組LDH值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示在缺氧條件下，體外純化培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞受損，細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，通透性增加，活性減弱。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通竅活血中藥復(fù)方含藥血清對(duì)正常條件下體外純化培養(yǎng)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的LDH漏出量無(wú)明顯影響(P＞0.05)，提示通竅活血中藥復(fù)方含藥血清對(duì)正常條件下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的細(xì)胞活性無(wú)明顯影響;加入中藥干預(yù)缺氧組樣本LDH漏出量較對(duì)應(yīng)缺氧組未加中藥干預(yù)樣本的數(shù)值明顯降低(P＜0.05)，提示通竅活血中藥復(fù)方含藥血清能明顯降低缺氧條件下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞膜通透性、提高胞膜穩(wěn)定性，從而減輕細(xì)胞損害，提高細(xì)胞活力。因此，筆者推測(cè)，通竅活血中藥復(fù)方能提高青光眼患者視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，增強(qiáng)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞活力，這可能是通竅活血中藥復(fù)方對(duì)青光眼患者視神經(jīng)保護(hù)的藥物作用途徑之一。

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Effect of Tongqiao Huoxue Decoction on retinal Müller cells cultured in hypoxic condition

QIN Wei，YANG Yu-qi，CHEN Yi-bing，ZHAI Nan，WANG Xue-jing，WANG Wei，LIU Chun-lan，ZHANG Yue，LI Yi，ZENG Dong-xing，LIU Dan

Q3

B

1672-6170(2017)04-0226-03

2017-02-13;

2017-06-10)

廣東省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(編號(hào):20122046);廣東省中山市科技局資助項(xiàng)目(編號(hào):20122A035)