黃 振，董衛(wèi)國

(武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

檢測人血清中5-羥色胺的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)方法

黃 振，董衛(wèi)國

(武漢大學人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

目的 建立一種快速、靈敏地測定血清中5-羥色胺的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)方法(LC-MS/MS)。方法采用同位素內(nèi)標稀釋法，直接沉淀蛋白，采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×50 mm，3.5 μm)，大氣壓化學電離源(APCI)，正離子模式，選擇5-HT的特征離子對177.1/160.0，內(nèi)標d4-5-HT的特征離子對181.1/164.0。結(jié)果5-HT在10～2000 ng/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9996)，定量下限為10 ng/ml，提取回收率＞85%，日內(nèi)和日間精密度＜15%。結(jié)論本LC-MS/MS技術(shù)方法準確可靠、重現(xiàn)性好，靈敏度高，適用于人血清樣品中5-HT的濃度測定。

5-羥色胺;血清;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

5-羥色胺(5-Hydroxytryptamine，5-HT)由色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶催化首先生成5-羥色氨酸，再經(jīng)5-羥色氨酸脫羧酶催化形成，最早是從血清中發(fā)現(xiàn)的，又名血清素，由吲哚和乙胺兩部分組成，是一種重要的生物胺，分子式C10H12N20，在20世紀40年代末期首次從血清中分離出一種縮血管物質(zhì)并將之命名為血清緊張素，1949年將其確定為5-HT。人體內(nèi)95%的5-HT在胃腸道的腸嗜鉻細胞及腸神經(jīng)元中合成，嗜鉻細胞受腸腔內(nèi)壓力和化學物質(zhì)刺激時通過旁分泌、腔內(nèi)分泌、內(nèi)分泌途徑釋放5-HT至血液，周圍組織和腸腔［1～3］。5-HT在人體中既是重要的神經(jīng)遞質(zhì)也是外周調(diào)質(zhì)，參與許多生理和病理過程，如胃腸道的運動、血小板的變形、刺激血管的收縮和舒張、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)功能以及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等。類癌瘤綜合癥、精神分裂癥、厭食癥、焦慮癥、抑郁癥、阿爾茨海默病、帕金森病、藥物引起的嘔吐、高血壓、偏頭痛、雷諾病，心律失常等疾病常伴有5-HT 的代謝異常［4～7］。因此，對血清中的 5-HT 進行含量檢測，對多種疾病的診斷和治療有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Q Exactive高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Thermo四元泵系統(tǒng)、CTC自動進樣系統(tǒng)、VORTE XKB-3旋渦混合器、BSA223 S分析天平、Eppendorf-5810R高速臺式離心機，Milli-Q Reference超純水儀。5-羥色氨(購自 Sigma公司，批號BCBG1337 V)、氘代5-羥色胺(購自CDN Isotopes公司，批號E344P59)、全氟戊酸(購自 Sigma公司，批號MKBN4540 V)、血清(購自 Sigma公司，批號H4522)、甲醇(色譜純)購自美國Fisher公司，實驗室用水為Milli-Q超純水。

1.2 色譜和質(zhì)譜條件色譜柱為Agilent Zorbax E-clipse XDB-C18柱(4.6 mm×50 mm，3.5 μm，批號LAAJ-93597-902)、流動相:1.25 mM全氟戊酸水溶液-甲醇溶液、柱溫:40℃、流速0.3 ml/min、進樣量10 μl;采用梯度洗脫程序，各段時間內(nèi)流動相比例及流速變化，見表1。離子源為大氣壓化學電離源(APCI)、全離子掃描范圍300～2000 m/z、歸一化碰撞能量35、鞘氣流速20，輔助氣流速5，吹掃氣流速0，毛細管溫度250℃，APCI氣化室溫度250℃。

1.3 標準溶液的制備精密稱取5-HT及其同位素內(nèi)標d4-5-HT對照品10 mg于10 ml量瓶中，加甲醇-水(80/20，v/v)的溶液溶解并稀釋定容，配制成1 mg/ml的5-羥色胺及其內(nèi)標儲備液。分別取適量1 mg/ml的5-HT及其同位素內(nèi)標d4-5-HT儲備液用甲醇-水(80/20，v/v)稀釋成濃度分別為20 μg/ml和100 ng/ml的工作液。分別取適量的工作液，用空白血清稀釋至標準曲線所需的濃度，配制成相當于 5-HT 血清濃度分別為 10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng/ml的標準系列溶液;分別取適量工作液，用空白血清稀釋至質(zhì)控樣本所需的濃度，配制成相當于5-HT血清濃度分別為30、200、1600 ng/ml的低、中、高質(zhì)控溶液。

表1 5-HT的梯度洗脫

1.4 血清樣本的處理取若干1.5 mlEP管，編號后精密吸取50 μl待測血清樣本，加入450 μl d4-5-HT溶液;立即渦旋混合30 s，室溫下放置5 min;再次渦混10 s，以10000 rpm轉(zhuǎn)速離心5 min;取上清液100 μl，加入 100 μl甲醇-水(80/20，v/v)，渦混 30 s，吸取10 μl進行LC-MS/MS分析。

1.5 基質(zhì)效應(yīng)計算取50 μl空白血漿，除不加內(nèi)標溶液外，按“1.4血血漿樣品處理”項下操作，每一濃度進行5個樣本分析，然后向100 μl的上清液中分別加入 100 μl 低、中、高濃度(30、200、1600 ng/ml)的5-HT和d4-5-HT溶液，渦流混合，取10 μl進樣分析，所獲得的峰面積(五次測定的平均值)記為Ci。另取5-HT標準溶液和d4-5-HT溶液，用流動相稀釋成相同濃度的標準溶液，每一濃度進行5個樣本分析，同樣取10 μl進樣分析，所獲得的峰面積(三次測定的平均值)記為Ai，基質(zhì)效應(yīng)(ME)=Ci/Ai ×100%［8，9］。

1.6 精確度及準確度測定按“1.3標準溶液的制備”的方法配制低、中、高三個濃度的質(zhì)控(QC)樣品(5-HT的血清濃度分別為30、200、1600 ng/ml)，每一濃度進行5樣本分析，連續(xù)測定三天，根據(jù)當日的標準曲線，計算QC樣品的檢測濃度。

1.7 穩(wěn)定性測定本實驗考察了5-HT血清樣品室溫放置3 h，經(jīng)沉淀蛋白處理后在室溫放置20 h，以及5-HT血清樣品經(jīng)歷3次冷凍－解凍循環(huán)，血清樣品冷凍(－20°C)放置45天的穩(wěn)定性。按“1.3標準溶液的制備”項下配制的低、高兩個濃度的血清樣品(5-HT的血清濃度分別為30、1600 ng/ml)，每一濃度進行3樣本分析，采用LC/MS/MS法來測定。

1.8 提取回收率的測定取空白血清 50 μl，按“1.3標準溶液的制備”項下操作，配制低、中、高三個濃度的樣品(5-HT的血清濃度分別為30、200、1600 ng/ml)，每一濃度進行5樣本分析，進樣體積為10 μl，所獲得的峰面積記為Bi。同時另取50 μl空白血清，其余操作同“1.5基質(zhì)效應(yīng)”的方法操作所得的峰面積記為Ci，提取回收率=Bi/Ci×100%。

2 結(jié)果

2.1 方法的特異性對已知的化合物5-HT及其同位素內(nèi)標d4-5-HT，在設(shè)定的條件下，經(jīng)過多次掃描比較，選定5-HT(m/z)的離子對為:177.13725→160.07448，d4-5-HT(m/z)的離子:181.12094 →164.09955。其二級全掃描質(zhì)譜圖，如圖1。在此離子對的基礎(chǔ)上，分別得到空白血清、空白血清添加標準系列溶液以及受試者的血清樣本的色譜圖，如圖2;5-HT及d4-5-HT的出峰時間，即保留時間約為1.3 min，峰形良好，無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，顯示出該方法條件下的5-HT及d4-5-HT的特異性好。

2.2 標準曲線及定量下限檢測得到10、20、50、100、200、500、1000、2000 ng/ml的系列濃度血清溶液的5-HT及相應(yīng)內(nèi)標的峰面積，以血清中5-HT的濃度為橫坐標(X)，待測物質(zhì)峰與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標(Y)，用加權(quán)(W=1/X)最小二乘法進行回歸運算，得直線回歸方程及其相關(guān)系數(shù)為:Y=0.00039818X-0.000715379，r=0.9996，建立了 5-HT的標準曲線，如圖3。結(jié)果表明血清中5-HT濃度在10～2000 ng/ml范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好;定量下限為10 ng/ml，檢測的精確度高。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)得到三個血清濃度下的5-HT和一個濃度下的d4-5-HT的基質(zhì)效應(yīng)，具體基質(zhì)效應(yīng)數(shù)據(jù)分別詳見表2。結(jié)果顯示，本試驗的血清樣本處理方法及LC-MS/MS分離條件，生物樣本的基質(zhì)效應(yīng)在可控范圍內(nèi)，得到的相對標準偏差RSD(又稱變異系數(shù))均小于6.7%，基質(zhì)效應(yīng)不影響5-HT血清濃度的測定。

2.4 精密度及準確度精密度通過測量值的相對標準差RSD來判定;準確度通過相對誤差RE(%)=(測量值/真實值)×100%。根據(jù)QC樣品結(jié)果計算本法的準確度與精密度，具體數(shù)據(jù)見表3。每一濃度水平的QC樣品的日內(nèi)RSD小于3.8%，日間RSD小于5.6%，RE在±4.9%之內(nèi)。

表2 5-HT的基質(zhì)效應(yīng) (%)

圖1 二級全掃描質(zhì)譜圖 a:5-HT;b:內(nèi)標d4-5-HT

圖2 LC-MS/MS測定人血清中5-HT(Ⅰ)及內(nèi)標d4-5-HT(Ⅱ)的典型色譜圖 a:空白血樣;b:空白血樣+5-HT對照品;c:受試者血清樣品

圖3 5-HT血清標準曲線

2.5 穩(wěn)定性高低兩個濃度的樣本在室溫放置3 h、處理放置20 h、3次解凍循環(huán)以及冰箱儲存的45天的長期放置等條件下的穩(wěn)定性測定，具體測得的數(shù)據(jù)見表4。結(jié)果表明，5-HT血清樣品室溫放置3 h穩(wěn)定(RE在±2.2%之間);經(jīng)沉淀蛋白處理后室溫放置20 h穩(wěn)定(RE在±1.1%之間);經(jīng)歷3次冷凍－解凍循環(huán)穩(wěn)定(RE在±0.3%之間);樣品樣品冷凍(－20℃)放置45天穩(wěn)定(RE在±2.9%之間)。

2.6 提取回收率血清樣品中5-HT的提取回收率數(shù)據(jù)祥見表5，提取回收率(%)均值大于85%，相對標準偏差RSD小于5.4%，具有較好的提取回收率。

表3 不同血清濃度5-HT的準確度和精密度

表4 5-HT的穩(wěn)定性

表5 5-HT的提取回收率

3 討論

評價一項新生物分析方法的優(yōu)劣，主要通過考察它的方法特異性、定量下限、響應(yīng)函數(shù)和校正范圍(標準曲線性能)、準確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、分析物在生物基質(zhì)以及溶液中儲存和處理全過程中的穩(wěn)定性以及提取回收率等特征［9～12］。本研究方法中的5-HT及d4-5-HT的出峰時間短，約為1.3 min，峰形良好且無內(nèi)源性物質(zhì)干擾，特異性好;定量下限達到10 ng/ml級別，檢測的精確度高，標準曲線的線性關(guān)系良好。精密度是描述分析物重復(fù)測定的接近程度，也是驗證重復(fù)性的好壞的一個指標，本研究中每一濃度水平的QC樣品的日內(nèi)RSD小于3.8%，日間RSD小于5.6%，數(shù)值遠低于批內(nèi)及批間變異系數(shù)不得超過15%的檢測標準;準確度是描述該方法下的測量值與分析物標示濃度的接近程度，通過相對誤差RE(%)來體現(xiàn)，準確度均值的相對誤差一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標示值的±15%之內(nèi)，顯然本研究的RE在±4.9%之內(nèi)，準確度高。本研究的基質(zhì)效應(yīng)的相對標準偏差RSD均小于7%，數(shù)值遠低于基質(zhì)效應(yīng)變異系數(shù)不得大于15%的檢測標準;高低兩個濃度的樣本在生物基質(zhì)以及溶液中儲存和處理全過程中的的穩(wěn)定性好，相對誤差RE小于±3%，完全符合RE應(yīng)在±15%之內(nèi)的標準。血清樣品中5-HT的提取回收率(%)均值大于85%，相對標準偏差RSD小于5.4%，具有較好的提取回收率。因此，本研究的分析方法各項特征指標均達到或高于檢測標準。

目前，檢測5-HT的方法主要有生物法、放射免疫法、放射酶法、熒光光度法、高效液相色譜-紫外光檢測法等［4，10］。早期的生物法現(xiàn)已不用;而放射免疫法雖有較好的靈敏度和特異性，但同位素標記對人體有害;熒光法雖使用較多，但操作麻煩，需要反復(fù)萃取，對檢測物質(zhì)有一定量的損失［13，14］;相比于這些檢測方法，本研究開發(fā)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)雖有儀器昂貴和建立方法復(fù)雜的局限，但具有靈敏度高、特異性強、準確度和精密度高、重復(fù)性好、定量下限低、樣本處理步驟簡單、進樣量少及檢測時間短等優(yōu)點。本實驗根據(jù)《化學藥物非臨床藥代動力學研究技術(shù)指導原則》的規(guī)定，建立了5-HT的LC-MS/MS定量分析方法，結(jié)果也顯示，LC-MS/MS的方法選擇性好、基質(zhì)效應(yīng)很低、回收率高、穩(wěn)定性好、定量下限低達10 ng/ml，完全能夠滿足生物樣品分析的要求，并且出峰時間僅為1.3 min，結(jié)果準確可靠，具有高通量的優(yōu)勢，更適合于臨床或科研中對5-HT的大批量樣本檢測。

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Determination of human serum 5-HT in by LC-MS/MS

HUANG Zhen，DONG Wei-guo (Department of Gastroenterology，People's Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China)

DONG Wei-guo

Objective To establish a rapid and sensitive method of liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LCMS/MS)for determination of 5-HT in human serum．MethodsUsing d4-5-HT as the internal standard(IS)，the sample was pretreated by simplified protein precipitated．Chromatography separation was performed on an Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6×50 mm，3.5 μm)column．APCI source was applied and operated in positive mode．The ion pair in quantitative analysis was m/z177.1/160.0(5-HT)，m/z181.1/164.0(d4-5-HT，IS)．ResultsFor 5-HT，calibration curve was linear in range from 10 to 2000 ng/ml(r=0.9996)．The limit of quantitation was 10 ng/ml．The recovery was more than 85%．The RSD of inter and intra day precisions were less than 15%，respectively．ConclusionThis method is found to be accurate，good reproducibility and sensitive for determination of 5-HT in human serum samples．

5-HT;Serum;LC-MS/MS

R446

A

1672-6170(2017)04-0041-05

2017-02-15;

2017-05-03)

董衛(wèi)國