鐘 凌，陳 姣，黃曉兵，李焱鑫

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a．檢驗科;b．血液科，四川 成都 610072)

血漿氧化還原電位在造血干細(xì)胞移植術(shù)后移植物抗宿主病監(jiān)測中的臨床應(yīng)用

鐘 凌a，陳 姣b，黃曉兵b，李焱鑫a

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a．檢驗科;b．血液科，四川 成都 610072)

目的 探討血漿氧化還原電位在監(jiān)測移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)中的臨床應(yīng)用。方法隨訪2009年1月至2015年12月進行造血干細(xì)胞移植的患者59例，移植術(shù)后定期隨訪同時取空腹靜脈血，測定血漿氧化還原電位。正常對照組由59例健康體檢者組成。結(jié)果正常對照組血漿RP值為-56.2～-11.2 mV。42例未發(fā)生GVHD患者血漿RP值為-20.8～21.1 mV，RP值波動幅度△mV為4.4～11.3 mV。17例發(fā)生GVHD患者血漿RP值為10.6～38.8 mV，△mV為25.8～61 mV。急性GVHD I級患者血漿RP值為9.8～27.3 mV，II級為3.7～35.1 mV，III級為19.6～43.9 mV，IV級為25.4～49.5 mV。結(jié)論血漿RP值的變化與GVHD可能具有一定的關(guān)聯(lián)，且無創(chuàng)、簡便，適宜于臨床推廣。

氧化還原電位;血漿;造血干細(xì)胞移植;移植物抗宿主病

造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)目前已被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植、生物免疫治療等領(lǐng)域［1］。移植物抗宿主病(graft versus-host disease，GVHD)是 HSCT的主要障礙。由于免疫遺傳學(xué)差異，植入的免疫活性細(xì)胞被受者抗原致敏而增殖分化，直接或間接攻擊受者細(xì)胞，對受者產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)與HSCT后的GVHD的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［2］。氧化應(yīng)激增強與氧化抗氧化失衡在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［3］。血漿氧化還原電位(redox potential，RP)是反映機體內(nèi)的氧化還原水平較為直接的指標(biāo)［4］，HSCT后GVHD的發(fā)生可能會伴隨血漿RP的改變，血漿RP的變化可在一定程度上反映GVHD的嚴(yán)重程度。

1 對象與方法

1.1 研究對象2009年1月至2015年12月在我院進行HSCT的患者59例，其中男39例，女20例，年齡21～48歲，年齡中位數(shù)39歲。移植術(shù)后隨訪15個月。正常對照組為同期59例健康體檢者，男39例，女20例，年齡20～50歲，年齡中位數(shù)38歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 用預(yù)冷肝素抗凝管采集患者清晨空腹靜脈血4 ml，1500 g離心20 min，分離出血漿，1 h內(nèi)完成檢測。

1.2.2 RP檢測 采用IPJ-PrE穩(wěn)壓器，以鉑電極為工作電極(表面積3.3×10-2cm2)，Ag/AgCl為參比電極，測定血漿電位，記錄電位變化30 min。每次測定前均需預(yù)處理測定電極［5］。

1.2.3 移植術(shù)后隨訪 HSCT術(shù)后患者一個月內(nèi)，每天進行RP檢測。頭三個月每周進行血常規(guī)檢查，每月進行骨髓形態(tài)學(xué)檢查、流式細(xì)胞術(shù)、肝腎功能常規(guī)檢查;術(shù)后第四個月起每月復(fù)查血常規(guī)，每3個月復(fù)查骨髓形態(tài)、流式細(xì)胞術(shù)、肝腎功能常規(guī)檢查。如有病情變化隨時復(fù)查，并進行相應(yīng)的組織學(xué)檢查和免疫學(xué)檢查。急性GVHD的臨床分級標(biāo)準(zhǔn)參照Thomas標(biāo)準(zhǔn)［6］，慢性GVHD的臨床分級標(biāo)準(zhǔn)參照 Schulman［7］標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

正常對照組血漿RP值為-56.2～-11.2 mV，中位數(shù)-32.7 mV。隨訪期間未發(fā)生GVHD患者42例(男24例，女18例)，血漿RP值為-20.8～21.1 mV，中位數(shù)0.2 mV。未發(fā)生GVHD患者的RP值長期處于較低水平，且波動幅度較小，△mV為4.4～11.3 mV。HSCT后未發(fā)生GVHD的患者隨訪期內(nèi)血漿RP值呈兩種變化:一種在觀察期內(nèi)其RP值保持平穩(wěn)，未出現(xiàn)較大范圍波動(圖1a);另一種在觀察期內(nèi)其RP值出現(xiàn)波動，即向正值偏移，但波動幅度較小，小于 25 mV(圖 1b)［6］。

圖1 隨訪期內(nèi)未發(fā)生GVHD患者的RP值變化趨勢 a:在觀察期內(nèi)RP值保持平穩(wěn);b:在觀察期內(nèi)RP值向正值偏移。

依據(jù)GVHD臨床診斷和分級標(biāo)準(zhǔn)，17例患者在HSCT后發(fā)生GVHD(男15例，女2例)，發(fā)生GVHD時的血漿RP值為10.6～38.8 mV，中位數(shù)24.6 mV(t=5.93，P＜0.05)，而且發(fā)生了較大幅度的波動，△mV為25.8～61 mV。

依據(jù)急性GVHD分級標(biāo)準(zhǔn)，將發(fā)生急性GVHD的患者分為I～I(xiàn)V級，I級患者血漿RP值9.8～27.3 mV，II級患者血漿RP值13.7～35.1 mV，III級患者血漿RP值19.6～43.9 mV，IV級患者血漿 RP值25.4～49.5 mV。但不同分級患者的血漿RP值變化情況與其臨床表現(xiàn)、治療效果變化情況相符合。分級較低患者在觀察期第15～18天血漿RP值出現(xiàn)正向波動，波動幅度△mV為39 mV，于第20天確診發(fā)生急性GVHD，I級;隨后予以治療，臨床表現(xiàn)和實驗室檢查指標(biāo)趨向正常、穩(wěn)定，患者的血漿RP值也逐步減低(圖2a)。分級較高患者HSCT后血漿RP值處于較高水平，觀察期第8～11天陡然向正值波動，波動幅度△mV為58 mV，第11天確診發(fā)生急性GVHD，IV級;隨后其血漿RP值逐漸升高，GVHD的嚴(yán)重程度逐步增加，于第16天死亡(圖2b)。

圖2 隨訪期內(nèi)發(fā)生GVHD患者RP值變化趨勢 a:在觀察期第15～18天血漿RP值出現(xiàn)正向波動，治療后血漿RP值逐步減低;b:HSCT后血漿RP值處于較高水平，觀察期第8～11天向正值波動，發(fā)生急性GVHD后血漿RP值逐漸升高，于第16天死亡。

3 討論

目前GVHD仍是HSCT尤其是異基因HSCT的主要障礙。GVHD不是一個單獨的疾病而是輸入受者體內(nèi)的供者淋巴細(xì)胞對“異物”做出的正常反應(yīng)，是由供者源免疫活性細(xì)胞介導(dǎo)的攻擊宿主細(xì)胞和器官的一種過度的炎癥反應(yīng)。因此GVHD可在很多臨床條件下發(fā)生，并且急性IV級GVHD病死率幾乎達(dá) 100%。如何早期、及時、非侵入性地診斷GVHD已成為移植術(shù)后亟待解決的問題之一。

炎性細(xì)胞因子是誘導(dǎo)和維持臨床GVHD的中心環(huán)節(jié)，三階段細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)是GVHD的病理生理學(xué)基礎(chǔ):第一階段，輻射和化療導(dǎo)致受者組織的損傷和激活，活化細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素－1(IL-1);第二階段，供者T細(xì)胞的激活以Th1細(xì)胞因子IL-2、干擾素－γ(IFN-γ)的分泌為特征;第三階段，由 IFN-γ 致敏的單核巨噬細(xì)胞分泌 IL-1、IFN-α［9］。TNF-α 是一種可引起多種生物學(xué)效應(yīng)的炎癥因子，包括直接誘導(dǎo)組織損害和引起代謝改變。植入同種異體骨髓和T細(xì)胞混合物的小鼠會發(fā)生嚴(yán)重的皮膚、腸和肺部損害，并伴有TNF-α水平升高，輸入其抗體可抑制靶器官損害，同時給予可溶性受體也可大大降低死亡率［10］。IL-1由激活的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，具有許多與TNF-α相似的生物學(xué)活性。小鼠同種異體骨髓移植模型中將IL-1注入宿主，受鼠出現(xiàn)消耗綜合征，死亡率增加。在小鼠GVHD模型中，移植后連續(xù)10天給予IL-1受體拮抗劑，防止了大多數(shù)動物發(fā)生GVHD［11］。因此，過度的炎癥反應(yīng)是GVHD的重要組成部分。

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)促氧化與抗氧化這兩個拮抗體系之間的平衡失調(diào)，促氧化作用增強，所引起的一系列病理生理損害。在正常體內(nèi)，促氧化/抗氧化處于一個平衡狀態(tài)，病理情況下，氧化作用超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，平衡被破壞，此時機體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加和/或清除能力降低，導(dǎo)致氧化物等在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起氧化損傷過程，由此造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和DNA的損傷［12］。而炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激有密不可分的關(guān)系，炎癥反應(yīng)過程中各種炎癥因子會刺激氧化產(chǎn)物的生成，從而產(chǎn)生更多的超氧化物，破壞促氧化/抗氧化的平衡［13～16］。血液中的RP是反應(yīng)機體內(nèi)促氧化/抗氧化狀態(tài)最直接的指標(biāo)，因此選用血漿RP來反映HSCT后患者的炎癥狀態(tài)［12］。

有學(xué)者嘗試通過測定RP值來檢測血液和其他生物體液、組織的RP［11］，并研究了RP測定方法的改進和結(jié)果的解釋等［17～19］。但是，由于在生物媒介中沒有獨立的、統(tǒng)一的RP值測量方法，包括測量電極的選擇(鉑金、黃金或碳)，因此，不同研究者獲得的數(shù)據(jù)在比較分析時的可靠性上存在問題［8］。Michael等［13］通過分析礦物鹽溶液中鉑電極表面上發(fā)生的化學(xué)過程的機制，發(fā)現(xiàn)了某些影響RP值測量的因素。從電化學(xué)的角度講，所謂的生物媒介的RP值是通過測定浸入目的媒介中的鉑電極的開路電位值來確定的。這一整體性特質(zhì)，大致上反映了內(nèi)穩(wěn)態(tài)的氧化還原平衡狀態(tài)。因此，測量RP為正數(shù)值表示一個平衡向氧化形式轉(zhuǎn)變，這可能表明即將發(fā)生氧化應(yīng)激的可能性，同樣，轉(zhuǎn)向負(fù)值的RP值表明抗氧化劑的優(yōu)勢及在體內(nèi)平衡中氧化過程的化學(xué)貢獻(xiàn)的相應(yīng)減少［20～23］?，F(xiàn)已證明測量PR值時主要的錯誤來源在于在測量時鉑電極表面氧化組分的改變，Michael等改進了鉑電極的預(yù)處理方法，從而極大地提高了RP數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性［8，24］。本研究中對血漿RP的測量，采用了Michael改進后的方法，以確保檢測數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性和可比性。

本研究結(jié)果顯示，正常對照組、未發(fā)生GVHD組、發(fā)生GVHD組之間血漿RP值存在差異，表明血漿RP用于HSCT患者術(shù)后是否發(fā)生GVHD，具有一定的診斷價值，且不同分級患者的血漿RP值變化情況與其臨床表現(xiàn)、治療效果變化情況可能有關(guān)。

基于RP數(shù)據(jù)分析及研究對象的臨床表現(xiàn)的比較，我們可以看到，正向的RP值的改變范圍大于25 mV(與監(jiān)測過程中的初始值進行比較)，表明移植術(shù)并發(fā)癥或移植功能障礙如移植排斥反應(yīng)的開始。一般改變的范圍大小反映了并發(fā)癥的嚴(yán)重性。而且上述改變通常先于移植機能障礙或急性排斥反應(yīng)的臨床癥狀出現(xiàn)之前，也先于血液標(biāo)志物的改變(例如血常規(guī)、骨髓形態(tài)學(xué)檢查、流式細(xì)胞術(shù)、肝腎功能常規(guī)檢查等)，這一點對于患者發(fā)生移植術(shù)后并發(fā)癥的早期診斷具有重要的臨床價值。

由于本研究納組病例數(shù)有限，因此較難確定血漿RP值正常參考范圍，有待進一步擴大研究病例以確定RP的正常值范圍、移植術(shù)后監(jiān)測GVHD的標(biāo)準(zhǔn)。但RP在移植術(shù)后并發(fā)癥的早期提示和病情評估方面的臨床價值，已經(jīng)有了初步的體現(xiàn)。

綜上所述，血漿RP值的檢測，可在一定程度上提示HSCT術(shù)后發(fā)生GVHD的風(fēng)險，其變化與患者臨床表現(xiàn)、治療效果的變化具有相關(guān)性，并且該方法簡便、無創(chuàng)、適于臨床推廣。

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Clinical application of the redox potential of blood plasma in monitoring GVHD after HSCT

ZHONG Linga，CHEN Jiaob，HUANG Xiao-bingb，LI Yan-xina(a．Clinical Laboratory，b．Department of Hematology，Sichuan Academy of Medical Sciences ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，China)

Objective To investigate the clinical application of Redox potential of blood plasma in monitoring graft-versus-host disease(GVHD)after hematopoietic stem cell transplantation(HSCT)．MethodsWe followed up 59 patients accepted HSCT from Jan 2009 to Dec 2015．During the regular follow-up after HSCT，fasting venous blood samples were taken and redox potential(RP)in blood was measured．At the same time，59 healthy subjects were used as normal control．ResultsThe plasma RP values were-56.2～ -11.2 mV in normal control group．The plasma RP values were-20.8～21.1 mV in 42 patients who did not have GVHD during the period of follow-up．The fluctuation range(△mV)were in 4.4～11.3 mV．The plasma RP values were 10.6～38.8 mV and △mV were 25.8～61 mV in 17 patients who had GVHD．The RP values were 9.8～27.3 mV，13.7～35.1 mV，19.6～43.9 mV and 25.4～49.5 mV in patients with I to IV degree of acute GVHD，respectively．ConclusionThe changes of blood plasma PR values may be associated with GVHD．The measurement of PR value is invasive and simple that is suitable for promotion．

Redox Potential;Plasma;HSCT，GVHD

R446.62

A

1672-6170(2017)04-0033-04

2016-11-18;

2017-03-24)