羅 鵬，張 維

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a．心血管內(nèi)科，b．老年醫(yī)學科，四川 成都 610072)

曲美他嗪通過抑制MicroRNA-423-5p凋亡信號通路保護H2O2引起的心肌缺血再灌注損傷

羅 鵬a，張 維b

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a．心血管內(nèi)科，b．老年醫(yī)學科，四川 成都 610072)

目的 探討曲美他嗪通過microRNA-423-5p(miR-423-5p)凋亡信號通路對H2O2引起的缺血再灌注損傷保護作用的分子生物學機制。方法培養(yǎng)小鼠心肌細胞，先以CCK-8和TUNEL檢測對比觀察H2O2對心肌細胞活性及凋亡的影響，同時以RT-q-PCR定量檢測各組心肌細胞內(nèi)miR-423-5p表達的情況。再通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞上調(diào)和下調(diào)miR-423-5p的表達，觀察心肌細胞的活性及凋亡情況。最后在H2O2誘導組中加入不同濃度曲美他嗪，檢測miR-423-5p和下游通道的表達以及細胞活性和凋亡情況。結(jié)果以H2O2處理小鼠心肌細胞會上調(diào)miR-423-5p的表達，同時降低心肌細胞的活性并引起凋亡(p＜0.01)。以質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細胞提高miR-423-5p表達可以降低心肌細胞活性并引發(fā)凋亡;降低miR-423-5p表達則可以減輕H2O2引起的細胞活性降低及凋亡效應(p＜0.01)。在H2O2處理組中加入曲美他嗪可以下調(diào)miR-423-5p的表達，同時減輕心肌細胞活性降低及凋亡比例(p＜0.01)。結(jié)論H2O2通過上調(diào)心肌細胞中的miR-423-5p表達誘導心肌細胞活性降低并引起凋亡，曲美他嗪通過抑制該miR的表達從而減少H2O2對心肌細胞活性的損傷并減少凋亡。

缺血再灌注損傷;microRNA-423-5p;H2O2;曲美他嗪

機體組織器官正常代謝有賴于良好的血液循環(huán)。各種原因造成的組織缺血，常常造成缺血性損傷。但在一定條件下恢復血液再灌注后，部分細胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞不但未減輕反而加重，這種血液再灌注后缺血性損傷進一步加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷。自由基對細胞的損害是造成缺血再灌注損傷的主要原因。H2O2是一種常見的氧自由基。H2O2在細胞內(nèi)的積累與心肌缺血再灌注損傷有明確的關系［1］。MicroRNA(miR)是一類內(nèi)生的、長度為20～24個核苷酸的小RNA，其在細胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。其調(diào)節(jié)方式主要是通過上調(diào)或下調(diào)表達量來完成的。本研究以不同濃度、時間強度的H2O2處理小鼠心肌細胞，觀察細胞活性和凋亡情況，同時測量細胞內(nèi)miR-423-5p的表達水平。進而通過調(diào)節(jié)該miR的表達來模擬或保護此種細胞損傷。最后觀察曲美他嗪對于H2O2誘導的細胞損傷的保護作用與該miR的關系。以期揭示曲美他嗪對缺血再灌注損傷的保護作用的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料實驗用小鼠心肌細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(上海)。曲美他嗪由施維雅公司(天津)提供。細胞培養(yǎng)所用試劑及RNA抽提、cDNA合成和q-PCR試劑盒均購買于ThermoFisherScientific公司(USA)。MicroRNA-423-5p、microRNA-423-5p-mimic質(zhì)粒及 pMIR-REPORT載體購買AmbionLifeTechnologies公司(USA)。質(zhì)粒擴增所用DH5α大腸桿菌菌株購買于Genewiz公司(美國)。細胞活性測定所用 CellCountingKit-8(CCK-8)檢測套件購買于BeyotimeInstituteofBiotechnology公司(美國)。細胞轉(zhuǎn)染用FuGENE?HD試劑盒均購買于Roche Diagnostics公司(USA)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和處理 所有的細胞培養(yǎng)都在37℃含5%CO2的濕潤空氣中以含10%胎牛血清的DMEM進行。細胞轉(zhuǎn)染依照FuGENE?HD轉(zhuǎn)染套件依照操作說明書完成。轉(zhuǎn)染操作時心肌細胞以2×105cell/孔的濃度種入6孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h達到70%～80%融合度。其后，取2 μg質(zhì)粒，以無血清的培養(yǎng)液，稀釋到 100 μl，再加入 5 μlFuGENE?HD轉(zhuǎn)染液，常溫反應15 min后加入6孔板后使用。H2O2處理時取70%～80%融合度的細胞，分別加入0、0.1、0.2、0.4 和 0.8 mM 的 H2O2，分別培養(yǎng) 12、24和48 h后行后續(xù)實驗。曲美他嗪處理時待細胞培養(yǎng)至70%～80%融合度，分別加入0、10、20、40和80 μM的曲美他嗪，培養(yǎng)心肌細胞24小時后行后續(xù)實驗。

1.2.2 載體構(gòu)建 將miR-423-5p和miR-423-5pmimic質(zhì)粒以DH5α大腸桿菌菌株擴增并提取，存于-20℃冰箱內(nèi)備用。質(zhì)粒濃度以ThermoND 2000分光光度計(ThermoFisherScientific，Inc．)測定。

1.2.3 細胞活性檢測 細胞活性以CCK-8測定套件測定，選定波長450 nm，每標本測定3次取平均值。

1.2.4 RT-q-PCR 依照操作手冊以TRIzol裂解液提取總RNA。采用cDNA合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進行RT-PCR操作。結(jié)果以Bio-RadCFX96 thermalcycler(Bio-Rad Laboratories，Inc．)檢測。

1.2.5 細胞凋亡檢測 使用DeadEndTMFluorometricTUNEL系統(tǒng)(Progega)，以操作說明書流程檢測心肌細胞中的凋亡細胞。TUNEL-陽性的細胞在DTX500熒光顯微鏡(Nikon)下可見細胞核有暗綠色熒光顯現(xiàn)，隨機選取5個視野取平均值進行相對計數(shù)。

1.2.6 MiR-423-5p 介導H2O2引起細胞活性降低及凋亡的檢驗構(gòu)建并引入miR-423-5p和miR-423-5p-mimic兩種質(zhì)粒(后者可以中和前者的活性)，并以miR-Control做空白對照進行檢驗。以RT-q-PCR檢驗以下各組心肌細胞活性，同時以TUNEL套件檢驗上述各組心肌細胞的凋亡情況:空白對照組、獨立H2O2(0.4 mM)處理組、H2O2(0.4 mM)聯(lián)合miRControl組、H2O2聯(lián)合miR-423-5p-mimic質(zhì)粒組以及獨立miR-423-5p質(zhì)粒組。

1.3 統(tǒng)計學方法使用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2降低心肌細胞活性并誘導miR-423-5p的表達以H2O2(0.4mM)處理12 h后心肌細胞活性明顯降低，繼續(xù)延長處理時間到24～48 h可以進一步降低心肌細胞活性;以H2O2(0.4 mM)處理12 h后心肌細胞中miR-423-5p的表達明顯上調(diào)，繼續(xù)延長處理時間到24～48 h后其表達會進一步上調(diào)(表1)。以0.1 mM濃度的H2O2處理心肌細胞24 h不會明顯降低其活性，但以0.2、0.4和0.8 mM濃度的H2O2處理則會明顯抑制心肌細胞的活性;同樣處理24小時，以0.2、0.4和0.8 mM濃度的H2O2處理后的心肌細胞中miR-423-5p的表達也是遞增的，而0.1 mM濃度的H2O2對該miR的表達影響不明顯(表2)。

表1 相同濃度H2O2(0.4 mM)不同時間長度處理心肌細胞后細胞活力及miR-423-5p的表達情況

表2 以不同濃度H2O2處理相同時間長度(24小時)處理心肌細胞后相對細胞活力對比

2.2 MiR-423-5p介導了H2O2誘導的心肌細胞活性降低和凋亡以miR-423-5p質(zhì)粒處理心肌細胞，可以將細胞內(nèi)miR-423-5p的表達水平提高到對照組的8.12±0.43倍(P＜0.01);而以 miR-423-5p-mimic質(zhì)粒處理，則會將其降低至對照組的0.26±0.03倍(P＜0.01)。單獨以H2O2處理或單獨以miR-423-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染均可以明顯降低心肌細胞活性;H2O2聯(lián)合miR-423-5p-mimic質(zhì)粒處理組對比對照組無明顯差異;以H2O2處理或以miR-423-5p質(zhì)粒導致過表達均會明顯增加心肌細胞的凋亡;以H2O2處理再以miR-423-5p-mimic抑制其表達則可以明顯減少凋亡情況(表3，圖1)。

表3 以不同方式處理心肌細胞后相對細胞活力及miR-423-5p的表達情況

圖1 不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H2O2處理后心肌細胞TUNEL照片(熒光標識存活細胞)

2.3 曲美他嗪通過抑制miR-423-5p的表達減輕H2O2誘導的心肌細胞活性降低及凋亡以H2O2(0.4 mM)分別聯(lián)合 0、10、20、40 和 80 μM 的曲美他嗪(TMZ，下同)處理心肌細胞48小時后，以RT-q-PCR檢驗miR-423-5p的表達水平。與0 μM組比較，10、20 μM 曲美他嗪組 miR-423-5p表達明顯降低，但繼續(xù)提高濃度不能進一步降低該miR的表達(表4)。以TUNEL檢驗上述各組心肌細胞的凋亡情況，以曲美他嗪抑制miR-423-5p的表達可以明顯減少心肌細胞的凋亡情況(表4，圖2)。

表4 以不同方式處理心肌細胞48 h后miR-423-5p的表達情況及細胞凋亡指數(shù)

圖2 不同濃度曲美他嗪干預H2O2處理后心肌細胞的TUNEL照片(熒光標識存活細胞)

3 討論

已有的大量研究表明，心肌活性降低和凋亡在缺血性心臟病、心力衰竭、心律失常等多種心臟疾患中扮演著重要的角色。在心肌細胞缺血再灌注損傷中，細胞中產(chǎn)生并積累的H2O2等自由基導致線粒體功能障礙、DNA損傷等多種細胞損害，引起細胞活性降低及凋亡，并最終導致心力衰竭和心律失常等后果［4］。為減輕此種損傷，保護心臟功能，研究人員進行了大量的實驗。

基于自由基損傷機制，我們有理由相信，可以直接對抗自由基的抗氧化劑可以在一定程度上保護心肌細胞，減輕缺血再灌注損傷。已有研究證實包括維生素C的一些抗氧化劑可以減輕過氧化物誘導的缺血再灌注損傷情況，保護心臟的功能［5］。另研究顯示，曲美他嗪等心肌代謝治療藥物同樣可以減輕心肌缺血再灌注損傷，改善預后［6］。但此種保護的機制明顯不同于抗氧化劑，一直未被完全明確。

近年發(fā)現(xiàn)，miR表達的改變見于各種心臟疾病中，除提供了新的可能的檢驗指標外，還提供了可能的治療靶點。miR-423-5p是其中較為受到關注的一個。目前已發(fā)現(xiàn)，miR-423-5p在慢性心力衰竭患者的循環(huán)中表達明顯上調(diào)，并與預后有關［7］。曲美他嗪可以改善缺血所致心力衰竭的預后［8］。

本實驗發(fā)現(xiàn)，H2O2可以誘導心肌細胞上調(diào)miR-423-5p的表達，且此種誘導呈時間和濃度依賴。此種表達的上調(diào)會降低心肌細胞活性，并誘導其凋亡。以miR-423-5p-mimic沉默miR-423-5p的表達可以抑制心肌細胞活性的降低，并減少凋亡。既往已有實驗提示 miR-423-5p的直接下游靶點 OGT、p-AMPK和26 s蛋白酶體都與凋亡相關［3］。部分揭示了自由基誘導心肌細胞凋亡的信號通路。

實驗同時發(fā)現(xiàn)，曲美他嗪可以減少H2O2誘導的miR-423-5p表達上調(diào)，在一定程度上阻斷miR-423-5p、OGT、p-AMPK和26 s蛋白酶體信號通路。從而減輕H2O2誘導的心肌細胞活性降低和凋亡，保護受到缺血再灌注損傷心肌?？梢圆糠纸忉屢郧浪哼M行心肌代謝治療為何可以減輕缺血再灌注損傷并保護心臟功能。

H2O2可以誘導心肌細胞上調(diào)miR-423-5p的表達，且此種誘導呈時間和濃度依賴，下調(diào)或者沉默該miR可以減少H2O2誘導的心肌細胞凋亡，一定程度上減輕自由基導致的心肌缺血再灌注損傷。這個結(jié)果提示 miR-423-5p可能可以作為一個有效的治療靶點來減輕心肌缺血再灌注損傷。

［1］Khurana S，Hollingsworth A，Piche M，et al．Antiapoptotic actions of methyl gallate on neonatal rat cardiac myocytes exposed to H2O2［J］．Oxid Med Cell Longev，2014，2014:657512

［2］Luo P，He T，Jiang R，et al．MicroRNA-423-5p targets O-GlcNAc transferase to induce apoptosis in cardiomyocytes［J］．Mol Med Rep，2015，12(1):1163-1168．

［3］Soukoulis V，Boden WE，Smith SC Jr，et al．Non-antithrombotic medical options in acute coronary syndromes:old agents and new lines on the horizon［J］．Circ Res，2014，6，114(12):1944-1958．

［4］Peng YW，Buller CL，Charpie JR．Impact of N-acetylcysteine on neonatal cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury ［J］．Pediatr Res，2011，70(1):61-66．

［5］Kane AD，Herrera EA，Camm EJ，et al．Vitamin C prevents intrauterine programming of in vivo cardio-vascular dysfunction in the rat［J］．Circ J，2013，77(10):2604-2611．

［6］蔣劉霞，傅國勝，壽曄，等．曲美他嗪對PCI術相關心肌缺血再灌注損傷及預后的影響［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)生，2014，52(19):4-7．

［7］Tijsen AJ，Creemers EE，Moerland PD，et al．MiR423?5p as a circulating biomarker for heart failure［J］．Circ Res，2010，2，106(6):1035-1039．

［8］劉南朝，周有華．曲美他嗪聯(lián)合瑞舒伐他汀對老年缺血性心肌病心力衰竭患者心功能及N-腦鈉肽前體的影響［J］．實用醫(yī)院臨床雜志，2015，12(3):124-126．

Trimetazidine targets microRNA-423-5p signal pathway to protect cardiomyocytes from H2O2-induced apoptosis in ischemic reperfusion injuries

LUO Penga，ZHANG Weib(a．Department of Cardiology，b．Geriatric Medicine，Sichuan Academy of Medical Sciences ＆ Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu，610072，China)

ZHANG Wei

Objective To investigate the molecular biological mechanism of the protective effect of trimetazidine against H2O2-induced apoptosis in ischemic reperfusion injuries．MethodsMouse cardiomyocytes were cultured．The effect of H2O2on cardiomyocytic activity and apoptosis was observed by detection of CCK-8 and TUNEL．Meanwhile，the expression of microRNA-423-5p(miR-423-5p)in myocardiocytes following exposure to H2O2was determined by using RT-q-PCR analysis．Further，up-or down-regulation of miR-423-5p were carried out through plasmid transfection to cells to observe the cardiomyocytic activity and apoptosis．Finally，expression of miR-423-5p and downstream as well as cardiomyocytic activity and apoptosis in the H2O2induce group after addition of various concentrations of trimetazidine．ResultsH2O2increased the expressions of miR-423-5p，decreased myocardiocytic activity and induced cell apoptosis(P ＜ 0.01)．The plasmid transfection to myocardiocytes increased the expression of microRNA-423-5p that decreased myocardiocytic activity and induced cell apoptosis．However，the decreased expressions of miR-423-5p could reduce the effect of H2O2(P ＜0.01)．Trimetazidine could decrease the expression of miR-423-5p and relieve the H2O2-induced decrease of myocardiocytic activity and apoptosis(P ＜ 0.01)．ConclusionH2O2induces the myocardial cell activity and apoptosis through up-regulating the expression of microRNA-423-5p．Trimetazidine targets microRNA-423-5p signal pathway to protect cardiomyocytes from H2O2-induced apoptosis in ischemic reperfusion injuries．

Ischemic reperfusion;MicroRNA-423-5p;H2O2;Trimetazidine

R541.4

A

1672-6170(2017)04-0026-04

2016-12-09;

2017-05-03)

張 維