徐龍?chǎng)危禧惱?，陳浩林，韓 雪，伍革民

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

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瑤山雞STAT5基因多態(tài)性及其與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性

徐龍?chǎng)?，朱麗莉，陳浩林，韓 雪，伍革民*

(貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

【目的】為瑤山雞繁殖性能的遺傳改良、輔助育種提供理論依據(jù)。【方法】采用DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)瑤山雞STAT5基因外顯子的遺傳多樣性進(jìn)行研究，并分析多態(tài)位點(diǎn)與繁殖性狀的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】瑤山雞STAT5基因存在11229 T→C、11298 T→C、10275 T→C、6571 T→C、6669 G→A、6732 G→A、6898 G→A、7142 G→A、7211 G→A、7219 G→A和7260 G→A等11個(gè)突變位點(diǎn)，其中，6898 G→A變異位點(diǎn)的雜合度和多肽信息含量最高，分別為0.5000和0.3750；7260 G→A變異位點(diǎn)的雜合度和多肽信息含量最低，分別為0.0950和0.0905；除6571 T→C、6732 G→A和7260 G→A 3個(gè)變異位點(diǎn)為低度多態(tài)外，其余8個(gè)變異位點(diǎn)均為中度多態(tài)；除6571 T→C和7260 G→A變異位點(diǎn)多態(tài)性與繁殖性狀無顯著性關(guān)聯(lián)外，其余位點(diǎn)均與繁殖性狀表現(xiàn)出顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)相關(guān)?！窘Y(jié)論】瑤山雞STAT5基因多態(tài)性與瑤山雞的繁殖性狀具有一定的相關(guān)性，為進(jìn)一步利用分子育種篩選瑤山雞高產(chǎn)雞群奠定了一定的基礎(chǔ)。

瑤山雞；STAT5基因；多態(tài)性分析；繁殖性狀；關(guān)聯(lián)分析

【研究意義】瑤山雞是貴州省的優(yōu)良地方雞品種，原產(chǎn)于廣西南丹和貴州荔波交界的瑤山地區(qū)，具有體型緊湊、羽毛鮮亮、個(gè)體大、生長快、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、飼料報(bào)酬高和肉質(zhì)鮮嫩等優(yōu)點(diǎn)而深受養(yǎng)殖戶喜愛，有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)利用價(jià)值。但瑤山雞的繁殖性能相對(duì)較差，年產(chǎn)蛋量僅90枚左右，且具有較強(qiáng)的就巢性，是制約瑤山雞養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素之一[1]。課題組前期對(duì)瑤山雞進(jìn)行了3個(gè)世代的常規(guī)選育，產(chǎn)蛋量從90枚提高到110枚左右，但常規(guī)選育進(jìn)展緩慢，因此探索與瑤山雞繁殖性狀相關(guān)聯(lián)的基因，開展常規(guī)育種與基因輔助選擇是提高瑤山雞繁殖性能的一種有效途徑。目前，課題組已對(duì)瑤山雞的多巴胺受體基因、催乳素基因、褪黑激素受體基因的多態(tài)性與產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究[2-4]。【前人研究進(jìn)展】信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)，是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。STAT5是STAT家族的一員，具有廣泛的生物學(xué)作用，主要參與免疫炎癥反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[6]。STAT5是GH、GHR、IGF、催乳素以及胰島素信號(hào)通路的重要調(diào)控因子，這些激素與生長、泌乳、新陳代謝密切相關(guān)[7-9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)STAT5基因的研究主要集中在基因結(jié)構(gòu)及功能方面，關(guān)于STAT5基因與雞的生長和繁殖性狀相關(guān)性研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】筆者以貴州瑤山雞為研究對(duì)象，通過分子生物學(xué)手段，研究STAT5基因外顯子的單核酸多態(tài)性，分析其與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性，旨在探明影響瑤山雞繁殖性能的有效變異，為瑤山雞繁殖性能的遺傳改良、輔助育種提供理論依據(jù)。

表1 STAT5基因引物序列信息

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)雞群

瑤山雞母雞F3代100只，選自貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)洛壩村種雞場(chǎng)，均采用常規(guī)飼養(yǎng)管理，個(gè)體籠養(yǎng)，群體一致性較好，性能較為穩(wěn)定。使用一次性肝素鈉抗凝采血管采取翅下靜脈采血1.0～1.5 mL，冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存。

1.2 性狀測(cè)定

120 日齡母雞轉(zhuǎn)入產(chǎn)蛋舍單只籠養(yǎng)至300 日齡，測(cè)定或觀測(cè)開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重、就巢性等繁殖性狀，測(cè)定方法按照NY/T 823-2004[10]進(jìn)行。

1.3 基因組DNA提取及引物設(shè)計(jì)

采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣DNA。根據(jù)GenBank中雞的STAT5基因外顯子編碼區(qū)序列(NC-006114)，應(yīng)用Primier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)4對(duì)引物(由天根生化科技有限公司合成)，引物信息見表1。

1.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，2×TaqPCR MasterMix 試劑10 μl，加ddH2O至20 μl。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性6 min；95 ℃變性30 s，特定溫度(表1)退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，委托諾賽基因組研究中心有限公司對(duì)100個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用DNAstar軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正，進(jìn)入基因庫網(wǎng)站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN軟件分析SNPs變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼變異的情況。用Excel軟件統(tǒng)計(jì)100只雞STAT5 基因分型，利用PopGen32軟件分析群體多樣性，用Spss 18.0軟件采用單因子方差分析方法分析基因型與繁殖性狀的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1STAT5基因的多態(tài)性

經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序分析，瑤山雞STAT5 基因有11個(gè)突變位點(diǎn)(表2)，其中，6898 G→A變異位點(diǎn)的雜合度和多肽信息含量最高，分別為0.5000和0.3750；7260 G→A變異位點(diǎn)的雜合度和多肽信息含量最低，分別為0.0950和0.0905。

2.2STAT5基因變異位點(diǎn)基因型與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性

從表3可知，瑤山雞6571 T→C和7260 G→A變異位點(diǎn)基因型與其繁殖性狀間無顯著性差異，其余位點(diǎn)均與某個(gè)繁殖性狀或多個(gè)繁殖性狀表現(xiàn)出顯著性或極顯著差異。

表2 瑤山雞STAT5基因的多態(tài)性

表3 瑤山雞STAT5基因變異位點(diǎn)基因型與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)性

續(xù)表3 Continued table 3

變異位點(diǎn)Variablesite基因型Genotype開產(chǎn)日齡(d)AFE300日齡產(chǎn)蛋量(枚)EN300首次就巢日齡(d)AFBB首次就巢持續(xù)時(shí)間(d)DAFBB首次就巢至重新開產(chǎn)間隔(d)IAFBBAE300日齡就巢次數(shù)(次)TBB300AG133.50±20.24b40.50±27.78B227.25±39.56b25.50±7.19b14.25±3.77B2.25±0.96bGG121.70±14.4357.85±33.97B242.20±83.07B18.95±11.5210.95±6.38B1.90±1.47b6898G→AAA124.86±13.9059.79±31.42252.86±87.2715.71±13.379.29±7.641.64±1.55AG122.18±16.3050.50±34.92a229.86±74.97a22.23±8.9912.77±4.59a2.27±1.20AGG116.71±12.7880.00±30.56b291.43±80.58b15.07±14.067.14±7.10b1.00±1.36B7142G→AAA121.89±13.8182.78±30.25a296.44±71.31a17.67±11.648.11±5.370.89±0.60aAG121.58±15.1849.68±33.71b228.42±81.44b19.58±12.9511.16±6.592.32±1.45bGG121.05±15.4762.68±33.49257.68±83.0617.68±12.0110.27±7.161.59±1.477211G→AAA122.84±12.5455.00±32.14a244.63±77.90a20.16±12.3812.05±6.92a1.79±1.36AG120.26±15.7852.84±34.14a224.37±84.36A18.89±10.7510.79±5.932.11±1.49GG120.92±17.3984.92±29.70b313.83±56.61Bb14.83±13.866.41±6.08b1.08±1.317219G→AAA122.29±15.2267.64±35.17257.57±92.5719.21±14.0810.36±7.691.71±1.64AG122.38±15.9747.92±31.56A224.37±77.45A21.04±10.24a12.00±5.36a2.13±1.29aGG118.42±12.3880.92±29.57B307.17±51.67B12.17±11.82b6.50±6.54b1.00±1.21b7260G→AAG122.17±16.3877.17±29.51289.33±87.7917.67±14.176.67±5.500.83±0.75GG121.30±14.7559.20±34.78248.67±81.6418.50±11.9710.70±6.661.86±1.46

注：同列同變異位點(diǎn)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示極顯著差異(P<0.01)。 Note： In the same column, values with different lowercase letters mean significant difference(P<0.05)，values with different capital letters mean highly significant difference(P<0.01).

3 討 論

STAT5基因是一種重要的調(diào)控因子，具有廣泛的生物學(xué)作用，能夠調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和死亡，參與細(xì)胞、組織及機(jī)體的生長和發(fā)育等。目前，關(guān)于雞STAT5基因遺傳效應(yīng)的研究報(bào)道較少，OU J T等[11]利用DNA池和PCR-RFLP方法，在北京油雞STAT5基因的5′調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)3個(gè)突變位點(diǎn)；趙秀華等[12]采用PCR-SSCP方法對(duì)京海黃雞STAT5基因的5′調(diào)控區(qū)部分序列進(jìn)行多態(tài)性分析，檢測(cè)到2個(gè)突變位點(diǎn)。對(duì)瑤山雞STAT5基因序列設(shè)計(jì)4對(duì)引物，經(jīng)多態(tài)性檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)11個(gè)突變位點(diǎn)，高于北京油雞和京海黃雞STAT5基因的5′調(diào)控區(qū)部分序列的突變位點(diǎn)，說明STAT5基因除了5′調(diào)控區(qū)部分的其余編碼區(qū)同樣存在基因變異位點(diǎn)。

多態(tài)信息含量和雜合度都是群體內(nèi)遺傳變異的度量指標(biāo)，雜合度值越大，群體內(nèi)遺傳變異越大。VALIZADEH M等[13]提出衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)，當(dāng)PIC>0.5時(shí)該變異位點(diǎn)為高度多態(tài)，當(dāng)0.25

4 結(jié) 論

瑤山雞STAT5基因存在11229 T→C、11298 T→C、10275 T→C、6571 T→C、6669 G→A、6732 G→A、6898 G→A、7142 G→A、7211 G→A、7219 G→A和7260 G→A等11個(gè)突變位點(diǎn)，多態(tài)性豐富，除6571 T→C和7260 G→A變異位點(diǎn)多態(tài)性與繁殖性狀無顯著性關(guān)聯(lián)外，其余位點(diǎn)均與繁殖性狀表現(xiàn)出顯著性或極顯著性相關(guān)，其多態(tài)性與瑤山雞的繁殖性狀具有一定的相關(guān)性，為進(jìn)一步利用分子育種篩選瑤山雞高產(chǎn)雞群奠定了一定的基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 馮 衛(wèi))

Polymorphism of GeneSTAT5 in Yaoshan Chicken and Its Association with Reproduction Traits

XU Long-xin，ZHU Li-li，CHEN Hao-lin，HAN Xue，WU Ge-min*

(Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinarian，Guizhou Guiyang 550005, China)

【Objective】The study aims to provide references for genetic improvement and assistant breeding of reproduction traits of Yaoshan Chicken. 【Method】The genetic diversity of geneSTAT5 was detected by DNA sequencing techniques，and an association analysis was conducted on polymorphic sites and reproduction traits. 【Result】The mutation sites (11229，11298,10275，6571 T→C and 6669，6732，6898，7142，7211，7219,7260 G→A)were found in amplified fragments of geneSTAT5. The site 6898 G→A has the highest heterozygosity and content of information in a polypeptide, the site 7260 G→A has the lowest ones, respectively 0.0950 and 0.0905. All the mutation sites were at intermediate polymorphic status，but the site 6571 T→C，6732 G→A and 7260 G→A. The association of polymorphisms revealed that 6571 T→C and 7260 G→A had no significant correlation with reproduction traits of Yaoshan chicken，the others all had significant(P<0.05)or highly significant(P<0.01)correlation with reproduction traits. 【Conclusion】Polymorphism of geneStaT5 in Yaoshan Chicken had some correlation with reproduction traits, which would lay a foundation for high-yield chicken selection through molecular breeding.

Yaoshan Chicken; GeneSTAT5; Polymorphism analysis; Reproduction traits; Association analysis

1001-4829(2017)6-1462-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.038

2016-09-21

貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院2014年博士基金項(xiàng)目“瑤山雞STAT5變異檢測(cè)及與產(chǎn)蛋性狀的關(guān)聯(lián)分析” ；貴州省科技基金項(xiàng)目“瑤山雞就巢性關(guān)鍵基因篩選”[黔科合J字(2014)2102]

徐龍?chǎng)?1981-)，男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，從事動(dòng)物遺傳育種研究，E-mail：15286045978@163.com，*為通訊作者：伍革民，E-mail:wgmabcdef@163.com。

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