謝美華，楊金奎，李雪玲，楊海艷*，陳莉莉，吳 帆

(1.楚雄師范學院化學與生命科學系，云南 楚雄 675000；2.省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091；3.云南省高校應用生物學重點實驗室，云南 楚雄 675000)

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紫果西番蓮炭疽病病原菌鑒定及生物學特性研究

謝美華1,2,3，楊金奎2，李雪玲1,3，楊海艷1,3*，陳莉莉1，吳 帆1

(1.楚雄師范學院化學與生命科學系，云南 楚雄 675000；2.省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650091；3.云南省高校應用生物學重點實驗室，云南 楚雄 675000)

【目的】對紫果西番蓮葉片炭疽病病原X-03進行分離鑒定，并對其生物學特性和殺菌劑對X-03的抑制作用進行研究?！痉椒ā坎捎眯螒B(tài)觀察與分子生物學相結合的方法?！窘Y果】X-03為刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)真菌，它的最適生長溫度為15～20 ℃，最適生長pH為 pH 8～9，當溫度高于50 ℃時X-03菌株的孢子不能萌發(fā)。X-03生長最適培養(yǎng)基為PDA，最適碳源和氮源分別為葡萄糖和NaNO3。供試的殺菌劑中以福美雙對X-03的抑制效果最好?！窘Y論】研究可為紫果西番蓮炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

紫果西番蓮；炭疽??；病原；生物學性狀

【研究意義】紫果西番蓮(PassifloraedulisSims.)是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬(Passiflora)多年生藤本攀緣植物[1-2]。西番蓮具有豐富的營養(yǎng)，被稱為“果汁之王”，果汁含量可達果重的30 %～40 %，具有濃郁的香味，且含有較高的有機酸和多達17種以上的氨基酸[3-5]。不僅如此，紫果西番蓮根、莖、葉均可入藥，性溫，無毒，歸肺經(jīng)，有祛風、鎮(zhèn)痛、活血、散癖、強體、健心等功效[6]。紫果西番蓮具有很大的經(jīng)濟應用潛力，在云南多個地方已有廣泛栽培[7]?！厩叭搜芯窟M展】植物炭疽病目前已對紫果西番蓮等多種植物造成極大危害[8]，如草莓[9]、黃瓜[10]、切花紅掌[11]、油茶[12]和枸杞炭疽病[13]等[14]。目前對紫果西番蓮炭疽病病原菌的鑒定和生物學特性方面的研究還未見報道?！颈狙芯康那腥朦c】采取形態(tài)學并結合多基因聯(lián)合分析，對紫果西番蓮炭疽病病原菌進行鑒定及生物學特性研究?！緮M解決的關鍵問題】旨在對紫果西番蓮炭疽病的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集自云南省楚雄師范學院校園內患有炭疽病的紫果西番蓮葉片，采用組織法對病原菌進行分離，經(jīng)科赫氏法鑒定其中一株為紫果西番蓮炭疽病的病原菌，菌株編號標記為X-03。

1.2 方法

1.2.1 X-03培養(yǎng)特征和菌株顯微結構觀察 觀察X-03在PAD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、分生孢子、分生孢子梗的形態(tài)特征。

1.2.2 rDNA-ITS，rDNA-GDPH序列擴增和分析 用改良CTAB法提取病原菌X-03的基因組DNA[14]。對病原菌的靶基因ITS(Internal Transcribed Spacer)和GPDH(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase)進行擴增，分別以ITS4/ITS5和CDF1/GDR1為引物，PCR擴增X-03菌株的ITS和GPDH序列。擴增產(chǎn)物送上海華大基因生物有限公司測序，所得序列在NCBI上比對，下載與其相似性較高的序列及其近似屬的序列。以鐮刀菌(Fusariumlateritium)作為外群，利用Clustal x將供試菌株與近源菌株的ITS和GPDH序列分別進行比對，用MEGA5構建各基因系統(tǒng)發(fā)育樹，并用bootstrap對系統(tǒng)發(fā)育樹進行檢驗，1000次重復。

1.2.3 X-03菌株生物學特性研究[10-12]

(1)不同培養(yǎng)基對X-03菌株生長的影響。PDA、紫果西番蓮葉煮汁(20 g葉片/L水)PDA (以下簡稱汁PDA)、燕麥瓊脂培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基，只加蒸餾水和瓊脂粉的培養(yǎng)基作對照。

(2)不同溫度對X-03菌絲生長的影響。將X-03菌塊分別接種在PDA上并置于5、10、15、20、25、30、35 ℃溫度下培養(yǎng)5 d并測量菌落直徑。

(3)不同 pH條件對X-03生長和孢子萌發(fā)的影響。將X-03菌塊分別接種到pH值為3～4、4～5、5～6、6～7、7～8、8～9、9～10、10～11的PDA上培養(yǎng)6 d并稱其干重。用X-03孢子分別制成1 mL pH為3～4、4～5、5～6、6～7、7～8、8～9、9～10、10～11的孢子懸浮液，28 ℃培養(yǎng)24 h后檢測萌發(fā)率，每次檢測100個孢子。

(4)不同碳源對X-03菌絲生長的影響。用查氏培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基，分別用相同含碳量的丙三醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖和葡萄糖為唯一碳源，配制成不同的碳源培養(yǎng)基。

(5)不同氮源對X-03生長的影響。以PDA為基本培養(yǎng)基，硝酸鈉為氮源，分別用相同含氮量的蛋白胨、氯化銨、硝酸銨和甘氨酸代替硝酸鈉，配制成不同氮源培養(yǎng)基。

(6)溫度對X-03孢子萌發(fā)的影響實驗。用X-03孢子制成1 mL孢子懸浮液，分別置于35、40、45、50、55、60 ℃溫度下培養(yǎng)， 24 h后鏡檢孢子的萌發(fā)情況。

1.2.4 不同殺菌劑對X-03菌株的抑制作用 用百菌清、甲霜·噁霉靈、福美雙和撲海因制成含有相同藥效成分帶藥PDA平板，無菌水作對照。接種相同大小的X-03菌塊，28 ℃培養(yǎng)。

以上生物學特性試驗中除1.2.3(2)除外，其余均在28 ℃培養(yǎng)5 d后測量菌落直徑，每個處理設3次重復。

2 結果與分析

2.1 紫果西番蓮炭疽病病原菌的分離、純化和致病性檢測

從患炭疽病的紫果西番蓮葉片中分離出到3株真菌，分別編號為X-01、X-02、X-03。分別接種離體葉片結果表明只有X-03號菌株接種的紫果西番蓮葉片發(fā)病，X-01、X-02菌株和對照組均不發(fā)病(表1)。X-03菌株針刺接種和無針刺接種的葉片均在6 d后出現(xiàn)可見病斑，接種部位呈黃褐色至黑褐色，周圍出現(xiàn)黑褐色小斑點，第10天病斑逐漸擴大，連成一片(圖1)。在葉片發(fā)病部位用組織分離法分離所得到的菌株菌落表型特征和X-03一致，表明X-03號菌株為引起紫果西番蓮炭疽病的病原菌。

2.2 X-03的形態(tài)特征

X-03菌株在PDA平板生長旺盛，菌落正面初始為粉白色、圓形、邊緣整齊，菌絲表面呈絨毛狀、較疏松，菌落背面為淺黃色菌落。后期菌落逐漸呈粉紅色，正面呈現(xiàn)中心圓環(huán)形隆起，向外輻射生長，第10 d后在菌絲表面形成大量橘黃色孢子堆；菌落背面以接種菌餅為中心，菌絲向外輻射環(huán)形生長。該菌分生孢子直，棒形，單孢、無色，內含原生質顆粒，頂端鈍圓一端漸尖，大小為10.33～20.03 μm×2.89～5.84 μm，平均大小為15.54 μm×4.89 μm，長寬比2.31～4.54。該病原菌和刺盤孢屬(Colletotrichum)的典型形態(tài)特征相符[15](圖2)。

圖1 離體葉片接種X-03第10天結果Fig.1 Symptoms of the leaves inoculated with X-03 after 10 days

菌株Strains針刺部位Acupuncturesite處理時間(d)Time1～5678910X-01菌株正面針刺------反面針刺------正面非針刺------反面非針刺------X-02菌株正面針刺------反面針刺------正面非針刺------反面非針刺------X-03菌株正面針刺-+++++++++++反面針刺-+++++++++++正面非針刺-+++++++++++反面非針刺-+++++++++++對照4種處理------

注：-表示葉片生長健康；+表示葉片現(xiàn)可見病斑；++表示可見病斑擴大；+++表示病斑變黑，葉片腐爛。 Note: -means leaf grow healthily; + means visible diseased spots; ++ means visible bigger diseased spots; +++ means visible black diseased spots and the leaves start decay.

2.3 X-03的ITS和GPDH基因測序和系統(tǒng)聚類分析

X-03的ITS和GDPH的擴增序列分別為573和225 bp。利用MEGA 4.0軟件構建了ITS和GDPH構建系統(tǒng)進化樹(圖3)。X-03與C.brevisporum、G.magna聚為一支，節(jié)點支持率為99 %，說明三者親緣關系較近；X-03與C.cliviae也有一個節(jié)點，節(jié)點支持率為100 %，說明二者的親緣關系也較近。系統(tǒng)進化分析表明X-03與刺盤孢屬(Colletotrichum)真菌的親緣關系最近，綜合形態(tài)學特征分析，X-03菌株被鑒定為刺盤孢屬 (Colletotrichumsp. X-03)。

2.4 病原菌X-03的生物學特性研究

2.4.1 不同碳源和氮源對X-03菌株生長的影響 X-03菌株對供試的5種氮源均能利用，菌落在不同氮源培養(yǎng)基上生長速度有明顯差異，該菌生長的最適氮源是NaNO3，其與蛋白胨、甘氨酸、NH4Cl和NH4NO3達到極顯著差異。供試的5種碳源均能利用，菌落在不同碳源培養(yǎng)基上的生長速度差異不明顯，該菌生長的最適碳源是葡萄糖，其與乳糖、淀粉達到極顯著差異(表2)。

2.4.2 不同溫度對X-03菌落生長的影響 接種在PDA上的X-03在10～35 ℃范圍內均能生長，其最適的生長溫度為15～20 ℃，在35 ℃時生長緩慢(圖 4)。

A：菌株X-03的菌落形態(tài)特征；B：40倍鏡下觀察到的分生孢子，標尺為10 μmA: Colony of X-03; B: conidia of X-03 are observed under the microscope, and the bar is 10 μm圖2 菌株X-03的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of X-03

圖3 X-03基于ITS和GPDH序列構建的NJ樹 Fig.3 The phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method based on ITS and GPDH sequences

2.4.3 不同培養(yǎng)基對X-03菌落生長的影響 X-03菌株在PDA、汁PDA、玉米粉、燕麥培養(yǎng)基以及對照上均能生長；菌株在PDA、汁PDA和燕麥培養(yǎng)基上生長較快，3者之間差異不顯著(P>0.05)，但它們與玉米粉培養(yǎng)基和對照的差異極顯著(P<0.01)(圖5)。2.4.4 不同pH對X-03生長和孢子萌發(fā)的影響 在PDA培養(yǎng)基中，X-03菌絲和分生孢子萌發(fā)適宜的pH值范圍較廣，在pH 3～11均能生長和萌發(fā)。pH 8～9時該菌的菌落直徑最大，同時孢子的萌發(fā)率也最高(表3)。

表2 不同氮源和碳源對X-03菌株生長的影響

注：表中不同大寫字母表示在P<1 %水平差異極顯著，不同小寫字母表示在P<5 %水平差異顯著。下同。 Note: Different capital letters mean significant difference at the 1 % level, different lowercase letters mean significant difference at the 5 % level. The same as below.

表3 不同pH對X-03菌株生長和孢子萌發(fā)的影響

表4 溫度對X-03孢子萌發(fā)的影響

注：+表示孢子可萌發(fā)；-表示孢子不萌發(fā)。

Note： + means that spores can germinate; -means that spores cannot germinate.

圖4 不同培養(yǎng)溫度對菌絲生長的影響Fig.4 Effect of different temperature on mycelial growth

圖5 不同培養(yǎng)基對X-03菌絲生長的影響Fig.5 Effect of different media on mycelial growth

2.4.5 溫度對X-03孢子萌發(fā)的影響 接種在PDA上的X-03菌株孢子在35～45 ℃均能萌發(fā)，50 ℃以上孢子不能萌發(fā)(表4)。

2.5 不同殺菌劑對X-03菌落生長的影響

與對照相比，4種殺菌劑對該菌的生長均有抑制作用。福美雙對該菌株的抑制效果最好，其次是百菌清和甲霜靈，抑制效果最差的是撲海因(圖6)。

3 討 論

3.1 紫果西番蓮病原菌的分離鑒定

對紫果西番蓮炭疽病葉片病菌進行分離與純化得到3個菌株，其中X-03為引起紫果西番蓮炭疽病發(fā)病的病原菌。X-03接種離體葉片結果表明葉片有無傷口均能發(fā)病，說明該菌通過直接侵染或機械傷口均能侵染紫果西番蓮，因此在種植時要注意病蟲害的及時防治和考慮合理種植密度，避免害蟲造成的傷口和種植密度太大葉片發(fā)生摩擦使葉片受到機械損傷產(chǎn)生傷口，從而通過傷口侵入加速該病害的傳染和擴散。依據(jù)X-03菌株的分生孢子和菌落形態(tài)等表型特征，并結合ITS和GPDH基因的系統(tǒng)進化分析結果把X-03菌株鑒定為刺盤孢屬(Colletotrichumsp. X-03)真菌。

圖6 不同殺菌劑對菌絲生長的影響Fig.6 Effect of different germicides on mycelial growth

3.2 病原菌生物學特性研究

X-03菌株對營養(yǎng)要求不高，能利用的碳源和氮源較廣。最適的生長培養(yǎng)基為PDA，對供試的5種碳源均能利用，最適碳源為葡萄糖和蔗糖，說明該菌能很好利用單糖、雙糖類中的碳源，這與多數(shù)真菌對碳源的利用能力相同[16-19]；對供試的5種氮源均能利用，最適氮源為NaNO3，說明X-03可能是嗜硝態(tài)氮類真菌；pH 8～9時分生孢子的萌發(fā)率最高，菌絲的生長也最好；X-03在15～20 ℃生長速度最快。本研究結果與該病害易在初春季節(jié)侵染葉片，引發(fā)葉斑病的發(fā)病規(guī)律相吻合。

3.3 殺菌劑對病原菌X-03生長的影響

供試的4種殺菌劑對X-03菌株的生長均有抑制作用。福美雙對該菌株的抑制效果最好，其次是百菌清和甲霜靈，撲海因效果最差。供試殺菌劑對該病在大田的防治效果需進一步試驗驗證。

4 結 論

引起紫果西番蓮葉片炭疽病的病原菌為刺盤孢屬(Colletotrichumsp. X-03)真菌，該病害易于初春傳播蔓延，福美雙對該病害的防治效果較好。

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(責任編輯 王家銀)

Study on Identification and Biological Characteristics of Anthracnose Pathogen ofPassifloraedulis

XIE Mei-hua1,2,3, YANG Jin-kui2, LI Xue-ling1,3, YANG Hai-yan1,3*, CHEN Li-li1, WU Fan1

(1.Department of Chemistry and Life Science, Chuxiong Normal University, Yunnan Chuxiong 675000, China; 2.Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources, Key Laboratory of Microbial Diversity in Southwest China, Ministry of Education, Yunnan University, Yunnan Kunming 650091, China; 3.Yunnan Province Applied Biology Key Laboratory of University, Yunnan Chuxiong 675000, China)

【Objective】The pathogen (X-03) of plant anthracnosis was identified fromPassifloraedulis, and it’s biological characteristics and inhibition effect of four fungicides on X-03 were investigated. 【Method】Morphologic observation combined with molecular biological techniques were employed in the paper. 【Result】The results showed that X-03 belonged to genusColletotrichum, and the optimal growth condition for this fungus was 15-20 ℃ and pH 8-9, while the spores could not germinate when the temperature over 50 ℃. The most suitable medium was PDA for X-03, and the optimal C and N sources were glucose and NaNO3, respectively. The inhibitory effect of Thiram on X-03 was more obvious than other tested germicides. 【Conclusion】This study could provide a theoretical basis for the prevention and control of anthracnose ofPassifloraedulis.

Passifloraedulis; Anthracnosis; Pathogen; Biological characteristics

1001-4829(2017)6-1358-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.6.021

2016-11-15

楚雄師范學院后備人才資助項目(XJRC1502)；云南省重點建設學科，楚雄師范學院重點建設學科基金項目(05YJJSXK03)；云南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃項目(IRTSTYN)；云南省教育廳項目(2014Y443)；云南省教育廳科學研究基金項目(2017ZZX016)

謝美華(1981-)，女，云南楚雄人，實驗師，碩士研究生，主要研究方向為微生物分子生物學，E-mail: xiemeihua@cxtc.edu.cn，Tel:0878-3100784, *為通訊作者：楊海艷，E-mail:haiyanyang@cxtc.edu.cn。

S667.9

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