張娟 陳美秀 商巾杰

（南京師范大學生命科學學院，南京 210000）

粟酒裂殖酵母中Mef2在線粒體中功能的研究

張娟 陳美秀 商巾杰

（南京師范大學生命科學學院，南京 210000）

由核編碼基因控制的線粒體翻譯對線粒體中電子傳遞鏈復合物的合成是必不可少的。旨在揭示粟酒裂殖酵母中Mef2蛋白的主要功能。利用同源重組的方法構建Δmef2突變體，觀察Δmef2在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵培養(yǎng)基的生長表型；生物信息學分析結果顯示Mef2的N端含有一段由31個氨基酸組成的線粒體定位序列（MTS），為進一步確定Mef2蛋白的定位，在Mef2的C端添加一個GFP熒光標記，觀察GFP綠色熒光的位置。接著采用Northern blotting檢測mef2的缺失對線粒體基因組編碼mRNAs的影響。最后，運用Western blotting檢測mef2的缺失對線粒體基因組編碼的蛋白的影響。研究結果表明，Δmef2菌株在非發(fā)酵培養(yǎng)基上表現(xiàn)出生長缺陷，是線粒體呼吸缺陷型菌；GFP綠色熒光定位實驗證實了Mef2定位于線粒體中；Northern blotting實驗結果顯示mef2的缺失不影響線粒體基因組編碼mRNAs的轉錄；Western blotting檢測結果顯示mef2的缺失導致Cox1、Cox3、Atp6和Cob1蛋白的表達量降低。綜上所述，Mef2是一個與線粒體功能密切相關的蛋白，并且參與了線粒體編碼蛋白Cox1、Cox3、Atp6和Cob1的翻譯。

線粒體；呼吸鏈；mef2；粟酒裂殖酵母

線粒體是一種含有線粒體DNA的半自主復制細胞器，能夠編碼構成呼吸鏈復合體的部分亞基。粟酒裂殖酵母線粒體DNA可以編碼24種tRNA、8種mRNA、2種rRNA及1個rnpB［1］。線粒體通過對糖、脂肪、氨基酸等氧化（放能）和ADP磷酸化（儲能）的偶聯(lián)反應完成能量轉換，達到合成ATP的目的，所形成的ATP直接為細胞生命活動提供95%以上的能量［2-4］。線粒體有自己的遺傳體系，能夠獨立進行DNA的復制、轉錄及蛋白質的翻譯，同時在線粒體的不同部位分布著大量的酶和輔酶，它們主要參與三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氨基酸代謝、能量轉換、脂肪酸分解、DNA復制和RNA合成過程［5，6］。線粒體的機能與人類健康密切相關，線粒體功能異常可引起許多人類疾病，如神經(jīng)退行性疾病，代謝綜合征、糖尿病，癌癥［7］、心臟病等。有關線粒體疾病在2012年發(fā)表于Nature 和 The LANCET的綜述中有詳細介紹［8，9］，有關線粒體功能的研究繼續(xù)成為熱點。

通過pombase數(shù)據(jù)庫分析，粟酒裂殖酵母中Mef2（SPBC660.10）被預測是一個線粒體蛋白，并且可能參與線粒體的翻譯過程。它具有兩個同源蛋白，分別是芽殖酵母中的Mef2和人體中的EFG2。在芽殖酵母，人們發(fā)現(xiàn)Mef2是一個線粒體翻譯延伸因子［10］，它參與線粒體的代謝過程，與線粒體的有氧呼吸密切相關，并且對維持線粒體基因組很重要［11-13］。研究表明，在人體中EFG2既是一個線粒體翻譯延伸因子［14］，也是一個線粒體核糖體循環(huán)因子［15，16］。EFG2基因缺失會誘發(fā)一系列由線粒體功能異常引起的疾病，如肌肉收縮異常等。過表達EFG2基因時，可以抑制由A3243G tRNALeu（UUR）MELAS引起的乳酸中毒和卒中樣發(fā)作的線粒體腦病［17］。由此可見，EFG2與線粒體功能有著密切的聯(lián)系。

雖然芽殖酵母中對mef2基因的研究已經(jīng)較為成熟，但粟酒裂殖酵母中mef2基因還沒有被報道，它的生物學功能尚不清楚。因此，本研究旨在探究Mef2蛋白在裂殖酵母中參與線粒體功能的機制，為研究粟酒裂殖酵母線粒體蛋白提供一定的理論依據(jù)。

1.1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 粟酒裂殖酵母單倍體菌株yAS56、pFA6a-KanMX6、FA6a-KanMX6-GFP為本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 YES培養(yǎng)基（per 100 mL）：3 g葡萄糖，0.5 g酵母粉，20 mg亮氨酸（L-leucine），20 mg尿嘧啶（Uracil），固體培養(yǎng)基加2.0 g的瓊脂粉。YES+6%甘油：將YES培養(yǎng)基中的葡萄糖成分替換為6%的甘油。

YES+G418培養(yǎng)基：在YES培養(yǎng)基的基礎上，補加KanMX濃度至100 mg/mL。KanMX是一種氨基苷類抗菌素衍生物，對真核細胞均有毒性作用，能阻斷細胞內蛋白質合成。KanMX用在酵母體系中，可擴大篩選使用菌株的范圍，便于提高外源基因的表達量。

1.1.3 儀器與試劑 PrimeSTAR DNA Polymerase和蛋白marker購自TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；SDS、瓊脂粉、HEPES、Sorbitol、Tris、Mops、30%丙烯酰胺和EDTA購自索萊寶公司；鮭魚精和氨芐霉素購自Sigma公司；尼龍膜、DIG標記及檢測Kit II購買于羅氏公司；甲醛、2×RNA Loading Buffer、DEPC水、DEPC為生工產品。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 粟酒裂殖酵母mef2基因序列來源于酵母基因組數(shù)據(jù)（S.pombe_GeneDB，http://www.pombase.org/）；粟酒裂殖酵母Mef2p及其人的同源蛋白EFG2的序列查找使用NCBI數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），芽殖酵母同源蛋白Mef2的查找使用SGD數(shù)據(jù)庫（http://www. yeastgenome.org/）；利用NCBI中的blastp進行序列同源性比對；線粒體信號肽預測分析采用MitoProt II（http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html）。

1.2.2 構建菌種 通過融合PCR的方法構建Δmef2突變體：在mef2的編碼區(qū)前后分別選擇約300 bp堿基作為上下游同源臂，以野生型基因組為模板擴增上下游同源臂，再以pFA6a-KanMX6（攜帶一個抗G418的kanR基因）質粒為模板，擴增KanMX篩選標記片段，最后用三段融合的方法擴增上游同源臂+KanMX+下游同源臂片段。醋酸鋰轉化方法將三段融合片段導入yAS56菌株中，利用G418進行篩選。另外，實施融合PCR實驗在mef2基因組上添加一個GFP標簽，構建出Mef2-GFP菌株。

1.2.3 點圈實驗 將活化好的yAS56和Δmef2單菌落分別接種于10 mL的YES液體中，30℃培養(yǎng)過夜，作為種子液。將各個菌的種子液轉接至新鮮YES液體培養(yǎng)基中至OD600為0.2。于30℃，220 r/min，培養(yǎng)12 h；收集菌液，調整初始OD600為3左右，以10倍差異進行梯度稀釋，不同濃度各取3 μL點圈于YES和YES+6%甘油培養(yǎng)基上；在30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，拍照。

1.2.4 GFP熒光定位 把已活化的Mef2-GFP菌接入YES液體中，30℃過夜培養(yǎng)，轉接至起始OD600約0.2，培養(yǎng)6-8 h后，OD600約0.8-1之間，取1 mL菌液，用PBS將細胞清洗一次，最終懸浮于200 μL PBS中，加入1 L Mitotracker Red染料，30℃，染色2 min，5 000×g離心1 min，棄上清，加入100 μL PBS重懸菌體，取3 μL懸濁液制成裝片，用于熒光顯微鏡觀察。制片后，利用Zeiss Axio imager A1 microscope（Zeiss，Jena，Germany）進行熒光觀察。在63倍油鏡下找到細胞，并在DIC通道拍照，然后轉換顯微鏡至GFP通道（GFP濾光片為Catalog No.41017），激發(fā)波長為488 nm，GFP信號通過Chroma（Brattleboro，VT）獲得，觀察熒光信號，并拍照，最后轉換顯微鏡至DsRed通道觀察紅色熒光信號，并拍照［18，19］。相機系統(tǒng)為Sensicam QE cooled digital camera system（Cooke Corp）；圖像整合系統(tǒng)為 MetaMorph/MetaFluor combination package analysis software（Uniwersal Imaging，West Chester，PA）；圖像后期處理使用Adobe Photoshop CS5（Adobe，San Jose，CA）。

1.2.5 Northern blotting 將yAS56和Δmef2菌株落接入YES液體培養(yǎng)基中，收集對數(shù)期的菌液，采用熱酚法抽提總RNA，將RNA混入乙醇中于-20℃保藏；取出適量的RNA進行處理，最后溶于DEPC水中，補充2×RNA Loading于65℃中孵育15 min，馬上放置冰上冰浴10 min，待電泳。對于RNA＞ 500 bp（rps3、atp6、cox1、cox2、cox3、cob1、rns、rnl）進行1%的瓊脂糖甲醛變性膠電泳，而＜ 500 bp的RNA（atp9、atp8、rnpB）使用6%的尿素變性膠進行電泳。紫外交聯(lián)完之后，在65℃中進行預雜交30 min，接著在42℃下雜交過夜，再用地高辛試劑盒進行檢測，最后采用圖像系統(tǒng)曝光5-20 min。線粒體基因探針采用帶有DIG標記的隨機引物進行PCR擴增或者引物5′端直接用DIG標記進行修飾。

1.2.6 線粒體純化和Western blotting 抽提Δmef2和yAS56菌株的線粒體［20，21］，利用Western blotting進行線粒體相關蛋白質的檢測。處理線粒體的粗提液：當檢測Cox2、Atp6、Cox4和內參Hsp60時，將粗提液與蛋白質Loading混勻放入100℃中水浴10 min；當檢測Cox1、Cob1和Cox3時，則將粗提液與蛋白質Loading混合物置于45℃中孵育3 min。通過Western blotting檢測，用ODDESSY進行掃描顯色。本研究選擇線粒體基質的蛋白HSP60作為內參，檢測線粒體相關蛋白Cox1、Cox2、Cox3、Cob1、Atp6及Cox4的表達量，抗體及稀釋比例分別為Anti-HSP 60（1∶1 000），Anti-Atp6（1∶1 000），Anti-Cox1（1∶1 000），Anti-Cox2（1∶500），Anti-Cox3（1∶500），Anti-Cox4（1∶1 000）和Anti-Cob1（1∶500）。

2 結果

2.1 Δmef2突變體和Mef2-GFP菌株的構建及鑒定

選擇mef2編碼區(qū)前面300 bp作為上游同源臂，編碼區(qū)后面250 bp作為下游同源臂，經(jīng)PCR擴增的產物如圖1-A所示；以pFA6a-KanMX6質粒為模板擴增出KanMX標簽的大小是1 357 bp（圖1-B）；上游同源臂+KanMX+下游同源臂的融合片段的大小是1 907 bp（圖1-C）。將融合片段導入到y(tǒng)AS56菌株里，挑選轉化子進行PCR驗證，結果如圖1-D所示，Δmef2突變體擴增出的目的基因大小是1 907 bp，野生型菌株擴增出的目的基因大小是3 107 bp，這說明Δmef2突變體構建成功。另外，運用融合PCR技術構建上游同源臂+GFP+KanMX+下游同源臂片段（圖2-A），大小2 694 bp。挑取轉化子用熒光顯微鏡進行檢測，可以觀察到綠色熒光（圖2-B），說明菌株Mef2-GFP構建成功。

圖1 Δmef2突變體的構建及驗證

圖2 Mef2-GFP菌株的構建及驗證

2.2 Δmef2在甘油為唯一碳源的培養(yǎng)基上的生長狀況

為了研究Mef2在粟酒裂殖酵母中的生理功能，構建了Δmef2菌株。采用線粒體功能缺陷菌表型生長的普遍研究方，即用以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵培養(yǎng)基來培養(yǎng)yAS56和Δmef2菌株。實驗結果如圖3所示，與野生型菌株相比，在發(fā)酵型培養(yǎng)基上，mef2基因缺失突變株生長狀態(tài)與野生型一樣；而在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上，Δmef2菌株生長趨勢明顯弱于野生型，表現(xiàn)出顯著的呼吸受損現(xiàn)象。這個實驗結果表明，Δmef2菌株是呼吸缺陷型菌株，mef2基因的缺失會導致粟酒裂殖酵母線粒體功能異常。

圖3 Δmef2在非發(fā)酵培養(yǎng)基上的生長情況

2.3 熒光顯微鏡觀察Mef2-GFP定位在線粒體

mef2基因的敲除會影響線粒體功能，這暗示著Mef2蛋白極有可能是進入線粒體中發(fā)揮功能。經(jīng)過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)Mef2的N端具有一段包含31個氨基酸的線粒體定位序列（MLRIVWKPLKIRLP VWRRYQSNISINSIRN），其可能性高達93.17%。因此，本研究采用線粒體染料示蹤法來確定Mef2的定位。以Mitotracker Red染活細胞線粒體作為線粒體marker，在熒光顯微鏡下發(fā)紅色熒光區(qū)域的就是線粒體；而Mef2-GFP菌株因為帶有綠色熒光標簽，則會在熒光顯微鏡下會呈現(xiàn)綠色熒光。如圖4所示，發(fā)現(xiàn)同一視野中綠色熒光和紅色熒光可以重疊，展現(xiàn)出Mef2與線粒體具有共定位現(xiàn)象，這說明Mef2定位于線粒體中。

圖4 Mef2-GFP的熒光顯微鏡觀察

2.4 mef2的缺失對cox1、cox2、cox3、cob1和atp6等的mRNA水平的影響

由前期實驗結果可知，mef2缺失菌株在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上生長明顯受損，影響粟酒裂殖酵母線粒體功能的正常發(fā)揮。因此推測mef2的缺失對于這些線粒體編碼蛋白的含量造成了影響，進而導致線粒體呼吸鏈功能的缺失。為了探究這種受損的原因，在實驗室已有實驗條件的前提下，我們從線粒體基因組編碼蛋白的合成途徑來進行研究。先利用Northern blotting實驗檢測線粒體基因組編碼蛋白的轉錄水平。

在真核生物進行有氧呼吸是通過線粒體中的電子傳遞鏈和氧化磷酸化的過程來實現(xiàn)的，電子傳遞鏈中的4個復合體是由核基因組編碼的蛋白和線粒體基因組編碼的蛋白共同組成的，其中Cox1、Cox2和Cox3參與組成呼吸鏈復合體Ⅳ，Cob1則參與組成呼吸鏈復合體Ⅲ，Atp6參與ATPase的合成，它們都是線粒體自身編碼的蛋白。

通過Northern blotting實驗來檢測cox1、cox2、cox3、cob1和atp6的mRNA水平。實驗結果（圖5）顯示，Δmef2菌株中cox1、cox2、cox3、cob1和atp6的mRNA水平和野生型yAS56相比，都沒有出現(xiàn)顯著性差異。這個結果說明Mef2不影響cox1、cox2、cox3、cob1和atp6 等的mRNA水平。

圖5 Northern blotting檢測Δmef2菌中線粒體基因組編碼的mRNAs水平

2.5 mef2的缺失會導致線粒體基因組編碼的蛋白表達量下降

Northern blotting實驗表明mef2的缺失不會影響cox1、cox2、cox3、cob1和atp6等 的 mRNA水平，說明Mef2可能與線粒體基因組編碼的蛋白翻譯有關。因此本研究利用Western blotting技術來分析線粒體基因組編碼的Cox1、Cox2、Cox3、Atp6和Cob1的表達量，進一步探究引起Δmef2菌株出現(xiàn)呼吸缺陷型生長表型原因。在本實驗中用Cox4作為對照以及用Hsp60作為上樣量控制，其中Cox4是一個由核基因組編碼的線粒體呼吸鏈相關蛋白。

與野生型菌株yAS56相比，Δmef2菌株中Cox3、Atp6和Cob1蛋白在線粒體中的表達量顯著降低，Cox1蛋白的表達量也出現(xiàn)一定程度的降低（圖6），這說明mef2基因的缺失會導致線粒體呼吸鏈相關蛋白表達量出現(xiàn)不同程度的降低。線粒體呼吸鏈上的復合體不能正常組裝，細胞不能正常進行氧化磷酸化及利用非發(fā)酵型碳源，導致了粟酒裂殖酵母細胞在非發(fā)酵碳源培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出呼吸缺陷型生長狀態(tài)。因此，mef2基因對線粒體呼吸鏈相關蛋白Cox3、Atp6和Cob1的表達非常重要，它的缺失會阻礙線粒體呼吸鏈復合物的合成，導致線粒體呼吸鏈無法發(fā)揮其正常功能。

圖6 Western blotting檢測Δmef2菌中線粒體基因組編碼的蛋白質表達量

3 討論

在芽殖酵母中Δmef2菌在以甘油為唯一碳源的非發(fā)酵培養(yǎng)基上也會表現(xiàn)出呼吸缺陷型生長；經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)芽殖酵母中mef2基因對維持線粒體DNA有著非常重要的作用［14］，另外，芽殖酵母中Mef2蛋白不僅參與線粒體編碼蛋白質翻譯中的延伸過程［22］，還涉及翻譯中核糖體的循環(huán)利用過程。而在本研究中發(fā)現(xiàn)粟酒裂殖酵母中mef2基因的缺失也會在非發(fā)酵型培養(yǎng)基引起生長緩慢。這說明mef2基因與線粒體功能存在密切的聯(lián)系。從生物信息學分析中可以得出：粟酒裂殖酵母中Mef2與芽殖酵母中的同源蛋白Mef2序列相似性大約是35%，與在人體中的同源蛋白EFG2的同源性達到41%。所以這3個蛋白存在著一定的同源性。因此，猜測粟酒裂殖酵母中的Mef2和其在芽殖酵母中的同源蛋白Mef2具有類似的功能。實驗結果已經(jīng)證明，粟酒裂殖酵母中mef2基因的缺失不影響線粒體相關蛋白質的mRNA水平，卻引起這類蛋白質的表達量銳減，證明它的確是參與線粒體相關蛋白質的翻譯過程。但是蛋白質的翻譯過程要經(jīng)過氨基酸的活化、肽鏈的起始、肽鏈的延伸、肽鏈的終止以及多肽鏈的折疊或加工。經(jīng)過NCBI Blast中的蛋白質分析結果中發(fā)現(xiàn)粟酒裂殖酵母中的Mef2存在推定的保守結構域，如翻譯延伸因子G結構域、翻譯延伸因子EFTu/EF1A結構域和小GTP結合蛋白結構域。這些保守結構域都表明Mef2很有可能參與蛋白質翻譯過程中肽鏈的延伸。而粟酒裂殖酵母中的Mef2是否也參與肽鏈的延伸還無法確定，需要后續(xù)用更多的實驗去驗證。

蛋白質的定位往往會與其功能相關。在芽殖酵母中Mef2已經(jīng)被證實定位于線粒體內膜上，雖然本研究已經(jīng)證實粟酒裂殖酵母中的Mef2定位于線粒體中，但是它在線粒體中的具體定位還不清楚，所以接下來可以設計更多的實驗來研究其具體定位，可以幫助我們更多的了解Mef2p在線粒體中所發(fā)揮的功能。

4 結論

本研究通過同源重組的方式敲除mef2獲得Δmef2突變體，發(fā)現(xiàn)Δmef2突變體是一種呼吸缺陷型菌。利用GFP熒光定位實驗證明了Mef2定位于線粒體中。運用Northern blotting技術得出mef2的缺失不影響cox1、cox2、cox3、cob1和atp6 等的mRNA水平。Western blotting實驗結果說明mef2的缺失會導致線粒體基因組編碼的Cox1、Cox3、Atp6和Cob1蛋白表達量下降。綜上所述，這些結果都闡明Mef2參與線粒體基因組編碼的Cox3、Cox1、Atp6和Cob1的翻譯。

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（責任編輯 李楠）

Function of Mef2 in Mitochondria of Schizosaccharomyces pombe

ZHANG Juan CHEN Mei-xiu SHANG Jin-jie
（College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210000）

Mitochondrial translation，essential for synthesis of the electron transport chain complexes in the mitochondria，is governed by nuclear encoded gene. This paper aims to reveal the main function of Mef2 protein in Schizosaccharomyces pombe. First，we constructed the strain of mef2 gene deletion by homologous recombination，and observed its growth phenotype in non-fermentative medium with glycerol as the sole carbon source. Second，the bioinformatics analysis demonstrated that the N-terminal of Mef2 contained a mitochondrial localization sequence（MTS）consisting of 31 amino acids. To further determine the localization of Mef2 protein，a GFP fluorescent label was added to the C-terminus of Mef2 to observe GFP green fluorescence. Third，Northern blotting was used to detect the effect of mef2 deletion on the level of mitochondrial genome encoding mRNAs. Finally，Western blotting was employed to detect the influence of the deletion of mef2 on the expression of mitochondrial genome-encoded protein. The results showed that Δmef2 strain caused growth defects on non-fermentation medium，which was one with mitochondrial respiratory defect. GFP green fluorescence localization experiments confirmed that Mef2 was localized in mitochondria. Northern blotting revealed that the deletion of mef2 did not affect the transcription of mRNAs encoded by the mitochondrial genome. Western blotting showed that the deletion of mef2 resulted in decrease in the expression of Cox1，Cox3，Atp6，and Cob1 proteins. In summary，Mef2 is a protein that is closely related to mitochondrial function and is involved in the translation of mitochondrial encoded proteins Cox1，Cox3，Atp6，and Cob1.

mitochondrial；respiratory chain；mef2；Schizosaccharomyces pombe

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0097

2017-02-17

國家自然科學基金青年基金項目（31400032），江蘇省高校自然科學研究項目（13KJB180010）

張娟，女，碩士研究生，研究方向：粟酒裂殖酵母線粒體蛋白對引發(fā)線粒體功能障礙的機制研究；E-mail：386347130@qq.com

商巾杰，女，副教授，研究方向：微生物生物化學與分子生物學；E-mail：464576900@qq.com