周東 劉貞 劉麗 許鵬程 鄭銀英

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

新疆辣椒CMV基因組序列分析與CP基因多克隆抗體制備

周東 劉貞 劉麗 許鵬程 鄭銀英

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832003）

克隆新疆辣椒LJ-10 CMV基因組片段，并進(jìn)行序列分析，構(gòu)建CMV CP基因的原核表達(dá)載體，并制備CP基因的多克隆抗體。利用RT-PCR技術(shù)，克隆新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1（3 357 nt）、RNA2（3 042 nt），RNA3（2 212 nt）全基因組片段，與GenBank上登陸的CMV亞組IA、亞組IB、亞組Ⅱ分離物進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。將LJ-10 CMV CP基因克隆到原核表達(dá)載體pET-22b中，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)純化，以純化的重組蛋白為抗原免疫兔子，制備CMV特異性抗血清，并進(jìn)行間接ELISA和Western blotting分析。結(jié)果顯示，成功克隆了新疆辣椒LJ-10 CMV的RNA1、RNA2、RNA3全基因組片段，序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該分離物屬于CMV亞組IB。成功構(gòu)建了LJ-10 CMV CP基因的原核表達(dá)載體pET-CMV-CP，在大腸桿菌BL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得了與預(yù)期大小一致的分子量約為27 kD的重組蛋白，制備了CMV的特異性抗血清。間接ELISA和Western blotting分析表明，制備的抗血清效價(jià)為1：500-1 000。新疆辣椒LJ-10 CMV分離物屬于CMV亞組IB，成功構(gòu)建了LJ-10 CMV CP基因的原核表達(dá)載體，制備了相應(yīng)的多克隆抗體。

黃瓜花葉病毒；序列分析；外殼蛋白；原核表達(dá)；蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是目前發(fā)現(xiàn)的寄主范圍和分布最廣、危害最嚴(yán)重的病毒之一，能侵染85科365屬1 000多種植物［1］，通過(guò)蚜蟲、種子、菟絲子和汁液摩擦接種等多種途徑傳播［2］。

CMV是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員，基因組為三分體單鏈正義RNA［1］。RNA1編碼1a蛋白；RNA2編碼2a蛋白，其亞基因組RNA4A 編碼病毒沉默抑制子2b 蛋白［3，4］，1a和2a蛋白均參與病毒的復(fù)制［5，6］；RNA3編碼3a移動(dòng)蛋白（Movement protein，MP），參與病毒移動(dòng)［7，8］，其亞基因組RNA4編碼外殼蛋白（Coat protein，CP），決定病毒粒子的移動(dòng)及病毒的蚜傳活性［9，10］。CMV依據(jù)基因組RNA3的5′端非編碼區(qū)和CP基因序列，劃分為CMV I和CMV II組［1］。CMV I進(jìn)一步劃分為CMV IA和CMV IB亞組，其亞組間核苷酸序列相似性為92%-95%［11］。有些CMV還攜帶基因組大小為332-405 nt單鏈、線狀衛(wèi)星RNA（Satellite RNA，satRNA）［12］。

CMV在我國(guó)新疆番茄、辣椒、南瓜、甜菜等蔬菜中均有發(fā)生，且不同寄主的CMV均歸為CMV IB亞組，然而辣椒的CMV在血清學(xué)和CP序列中存在較大的變異［13-15］。目前，不同地域的西番蓮、加工番茄、煙草等植物中的CMV分離物的CP基因通過(guò)原核表達(dá)，制備了高特異性抗體，從而為快速地檢測(cè)不同地域、不同寄主中的CMV奠定了基礎(chǔ)［16，17］。因此本研究從感染CMV的辣椒中提取dsRNA，利用RT-PCR技術(shù)克隆了RNA1、RNA2、RNA3全基因組片段，并通過(guò)原核表達(dá)CP基因制備基因工程多克隆抗體，以期為我國(guó)新疆CMV高效、快速血清學(xué)檢測(cè)提供保障。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年從石河子蔬菜研究所采集感染CMV，編號(hào)為L(zhǎng)J-10辣椒樣本提取dsRNA［18］。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3），原核表達(dá)載體pET-22b為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)GenBank登錄CMV株系或分離物序列設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

表1 擴(kuò)增CMV RNA1、RNA2、RNA3的RT-PCR引物

1.2.2 CMV基因組RT-PCR擴(kuò)增 從LJ-10樣本上提取的dsRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，具體反應(yīng)體系為：dsRNA 3 μL、隨機(jī)引物2 μL、DEPC-H2O 5 μL混勻，95℃ 10 min，立即冰浴 2-5 min。繼續(xù)加入5 μL 5 × AMV buffer、0.3 μL RNase Inhibitor（40 U/μL）、0.7 μL AMV（10 U/μL）、3 μL 2.5 mmol/L dNTPs、6 μL DEPC-H2O， 為25 μL體系。 混勻，42℃ 60 min，最后70℃ 15 min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收、純化預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物后，連接至pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB（含 50 μg/L氨芐青霉素）培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)14-16 h，挑取單菌落，提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定重組質(zhì)粒正確后，由上海英駿生物技術(shù)有限公司北京測(cè)序部公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 序列分析 用DNASTAR軟件進(jìn)行序列相似性比較，用遺傳進(jìn)化分析軟件MEGA5.0鄰接法（Neighbor- Joining）計(jì)算序列間的遺傳距離。Bootstrap為1 000重抽樣統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)各枝的置信度，同時(shí)，進(jìn)化樹構(gòu)建中引入花生矮化病毒（Peanut stunt virus，PSV）ER（U15730）株系為外群。所用分離物如下：CMV亞組IA：Fny（D00356、D00355、D10538）；Leg（D16403、D16406、D16405）；Mf（AJ276479、AJ276480、AJ276481）；Y（D12537、D12538、D12499）；O（*、D10209、D00385）。CMV亞組IB：Nt9（D28778、D28779、D28780）；Tfn（Y16924、Y16925、Y16926）；IX（U20220、U20218、U20219）；SD（AF071551、D86330、AB008777）；IA（AB042292、AB042293、AB042294）；Phy（DQ402477、DQ412731、DQ412732）。CMV亞 組II：Q（X02733、X00985、M21464）；Ly（AF198101、AF198102、AF198103）；S（Y10884、Y10885、U37227、AF063610）；LS（AF416899、AF416900、AF127976）；Trk7（AJ007933、AJ007934、L15336）。1.2.4 原核表達(dá)蛋白純化與多克隆抗體制備 根據(jù)辣椒上獲得的CMV RNA3 序列設(shè)計(jì)合成CMV S/CMV A引物，擴(kuò)增CP基因，之后利用Noc I/BamH I雙酶切，將LJ-10 CP基因重組到原核表達(dá)載體pET-22b，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-CMV CP，轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，以空載體pET-22b為對(duì)照，37℃ 1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2-6 h，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)。按照Novagen公司的Ni NTA His-bind resin親和柱洗脫目的蛋白，生理鹽水透析，冷凍干燥。將純化后的抗原按照常規(guī)方法免疫4只4個(gè)月大、2.1 kg健康新西蘭雄性大白兔，免疫4次后取抗原，親和純化分離血清，-20℃保存。

1.2.5 多克隆抗體效價(jià)測(cè)定與Western-blot分析 取0.1 g 樣本新鮮嫩葉加入10×體積的緩沖液（PBST + 2% PVP）充分研磨，離心后的上清為抗原，以制備的CMV多克隆抗體為一抗，堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行間接ELISA，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為405 nm 處讀取吸光度值，P/N≥2視為陽(yáng)性樣品。

為進(jìn)一步驗(yàn)證所制備的CMV抗體的有效效價(jià)，以本文制備的CMV CP基因的多克隆抗體為第一抗體，堿性磷酸酯酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體，以NBT和BCIP為顯色底物，取0.1 g已用間接ELISA方法檢測(cè)含有CMV病毒的植株葉片，用液氮充分研磨，加10×總蛋白提取液（0.5 mol/L Tris-HCl pH8.0+4% β-巰基乙醇+ 40%蔗糖+0.2% SDS）充分混勻，冰浴30 min，4℃ 10 000 r/min離心20 min，取上清，用于蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 CMV基因組結(jié)構(gòu)分析

以從辣椒上提取的dsRNA為模板，利用RTPCR和TA克隆技術(shù)獲得辣椒LJ-10的CMV全基因組序列。其中RNA1 長(zhǎng)3 357 nt，內(nèi)含1a ORF（97-3 075，2 979 nt），推導(dǎo)編碼993 aa的1a蛋白；RNA2長(zhǎng)3 042 nt，內(nèi)含2a ORF（76-2 649，2 574 nt）和2b ORF（2 411-2 743，333 nt），分別推導(dǎo)編碼858 aa 的2a蛋白和111 aa的2b蛋白；RNA3 長(zhǎng)2 212 nt，內(nèi)含3a ORF（122-958，837 nt）和CP ORF（1 257-1 910，654 nt），分別推導(dǎo)編碼279 aa 的3a蛋白和218 aa 的CP蛋白。

2.2 CMV基因組序列分析

CMV LJ-10基因組序列與GenBank上登陸的CMV亞組IA、亞組IB、亞組II不同分離物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。RNA1、1a、RNA2、2a、2b、RNA3、3a、CP系統(tǒng)進(jìn)化樹和序列相似性分析結(jié)果（圖1）顯示，LJ-10屬于CMV亞組IB。

進(jìn)一步將CMV LJ-10與CMV亞組IB 6個(gè)分離物進(jìn)行序列比較發(fā)現(xiàn)，LJ-10 RNA1、1a、RNA2、2a、2b、RNA3、3a與SD（中國(guó)，煙草）分離物序列相似性較高（表2），親緣關(guān)系較近在系統(tǒng)進(jìn)化樹上處于一個(gè)分支（圖1-A、B、C、D）。

LJ-10、IA（日本，未知）、IX（美國(guó)，番茄）3個(gè)分離物的 CP核苷酸序列相似性較低，為92.2%-93.3%；與其他SD、Phy（中國(guó)大陸，不詳）、Nt9（中國(guó)臺(tái)灣，不詳）、Tfn（意大利，番茄）4個(gè)分離物的相似性也較低，為92.7%-93.9%；SD、Phy、Nt9、Tfn 4個(gè)分離物間相似性較高，為94.7%-99.7%（表2）。以CP核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹上LJ-10與SD分離物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與IX、IA親緣關(guān)系較近處于一個(gè)分支（圖1-E）。

圖1 CMV 1a（A）、2a（B）、2b（C）、3a（D）和CP（E）核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

CMV LJ-10的 1a、2a、2b、3a、CP氨基酸序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果與核苷酸序列分析結(jié)果基本一致。

表2 CMV-LJ-10與亞組IB分離物的基因組RNA及推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)

2.3 CMV CP原核表達(dá)蛋白的多克隆抗體制備

構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-CMV CP 37℃ 1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)2-6 h獲得分子量約為27 kD與預(yù)期目的大小一致的重組表達(dá)蛋白（圖2）。CMV CP蛋白長(zhǎng)218 aa，推導(dǎo)編碼大小約24 kD蛋白質(zhì)，本文使用Noc I/Bam HI雙酶切將CMV CP基因構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET-22b，獲得重組質(zhì)粒pET-CMV CP。即CMV CP蛋白融合pET22b載體 C端含6個(gè)His標(biāo)簽的21 aa，所以實(shí)際表達(dá)蛋白大小約為27 kD。

將CMV CP原核表達(dá)重組蛋白純化后免疫兔子制備多克隆抗體。以未免疫的兔血清為對(duì)照，采用常規(guī)間接ELASA法測(cè)定，制備的抗血清可與0.2 μg/孔純化抗原有很強(qiáng)的特異反應(yīng)。

2.4 CMV多克隆抗體的效價(jià)分析

2015年7-8月，從石河子蔬菜花卉研究所和石河子大學(xué)北區(qū)試驗(yàn)田采集辣椒和加工番茄樣本，以本實(shí)驗(yàn)制備的CMV抗體為一抗，間接ELISA可有效檢出CMV，辣椒和加工番茄上CMV的檢出率分別為54.1%（13/24）和60%（6/10）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性的辣椒和加工番茄樣品提取的總蛋白為抗原，進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果同樣顯示與預(yù)期大小一致的大小約24 kD蛋白質(zhì)（圖3和圖4）。間接ELISA和Western blot分析結(jié)果顯示，本文制備的CMV抗血清1:500-1 000稀釋均可有效地檢測(cè)新疆辣椒和加工番茄上CMV。

圖2 CMV CP表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

3 討論

CMV是迄今已知病毒中寄主范圍最廣泛的病毒，具有高度變異性和強(qiáng)適應(yīng)性，在寄主上產(chǎn)生花葉，矮化，厥葉，褪綠，過(guò)敏性壞死等癥狀，這些癥狀大多以混合性出現(xiàn)，在新疆CMV也常與其它病毒混合侵染［19］，產(chǎn)生多種不同的癥狀［20］。通常CMV亞組I引起較嚴(yán)重的壞死、失綠、矮化或蕨葉等癥狀，而CMV亞組II只引起較溫和的斑駁和花葉癥狀，并在接種葉上產(chǎn)生蝕紋斑［1，21-22］。已報(bào)道CMV亞組IA和CMV亞組II在全世界范圍內(nèi)都有分布，而CMV亞組IB主要在亞洲地區(qū)，且CMV亞組IB的變異率高于CMV亞組IA和CMV亞組Ⅱ變異率［11］。

圖3 感染CMV的辣椒葉組織的Western blot特異性檢測(cè)

圖4 感染CMV的加工番茄葉組織的Western blot特異性檢測(cè)

新疆番茄、辣椒、南瓜、甜菜等等不同寄主植物上的CMV均歸為CMV IB亞組，使用從美國(guó)NEOGEN生物技術(shù)有限公司購(gòu)買的CMV I型抗體可以有效檢測(cè)番茄、南瓜等寄主上CMV，然而從新疆石河子蔬菜研究所蔬菜種子繁育基地上采集的辣椒樣品上其檢出率極低，在加工番茄上也存在漏檢的現(xiàn)象［15］。酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immol/Lunosorbent assay，ELISA）是目前應(yīng)用非常廣泛的適用于大田大量樣品病毒病的快速檢測(cè)的免疫學(xué)方法，利用病毒外殼蛋白制備基因工程抗體，已廣泛應(yīng)用于CMV抗血清的制備［16］。

CMV是新疆加工番茄、辣椒等經(jīng)濟(jì)類蔬菜上危害最嚴(yán)重的病毒［23-25］，因此本文從美國(guó)NEOGEN公司CMV I型抗體血清學(xué)檢測(cè)為陰性的新疆石河子蔬菜研究所采集辣椒LJ-10克隆、分析了CMV全基因組序列，并以其CP基因制備了多克隆抗體，為新疆CMV檢測(cè)、預(yù)防及研究病毒與寄主互作奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，新疆辣椒LJ-10 CMV分離物屬于CMV亞組IB；成功構(gòu)建了LJ-10 CMV CP基因的原核表達(dá)載體，制備了相應(yīng)的多克隆抗體，抗血清效價(jià)為1∶500-1 000，能夠有效的用于新疆辣椒和加工番茄的檢測(cè)。

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(責(zé)任編輯 朱琳峰）

Genome Sequencing of CMV Isolated from Pepper in Xinjiang and Polyclonal Antibody Preparation of CP Gene

ZHOU Dong LIU Zhen LIU Li XU Peng-cheng ZHENG Yin-ying
（College of Life Sciences，Key Laboratory of Agriculture Biotechnology of Shihezi University，Shihezi University，Shihezi 832003）

This work aims to clone gene fragment of Cucumber mosaic virus（CMV）from pepper LJ-10 in Xinjiang，to analyze the sequence，construct the prokaryotic expression vector of CMV CP gene，and to prepare CP’s polyclonal antibodies. The complete genome fragments of RNA1（3 357 nt），RNA2（3 042 nt），and RNA3（2 212 nt）were cloned by RT-PCR，and compared with different CMV isolates from CMV subgroup IA，subgroup IB and subgroup II in the GenBank by sequence analysis and phylogenetic tree analysis. The CP gene of CMV in LJ-10 was cloned into prokaryotic expression vector pET-22b and expressed in Escherichia coli BL21（DE3），and the expressed proteins were purified. Rabbit was immunized with the purified protein to prepare the antiserum with CMV-specificity，and detected by indirect ELISA test and Western blot. As results，the genomes of RNA1，RNA2，and RNA3 were successfully cloned，the sequence analysis and phylogenetic tree analysis showed that the isolates belonged to CMV subgroup IB. The prokaryotic expression vector pET-CMV-CP was successfully constructed and expressed as a 27 kD recombinant protein in E. coli BL21（DE3）by IPTG induction，and whose molecular weight was identical to the expected one. The indirect ELISA test and Western blotting showed that the antiserum’s titer was 1：500-1 000. In conclusion，the CMV isolate from LJ-10 belongs to CMV subgroup IB. The prokaryotic expression vector of CMV CP gene from LJ-10 is successfully constructed，and the corresponding polyclonal antibody is prepared.

Cucumber mosaic virus；sequence analysis；coat protein gene；prokaryotic expression；Western blot

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0206

2017-01-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460466）

周東，男，碩士研究生，研究方向：植物分子遺傳學(xué)；E-mail：983692757@qq.com

鄭銀英，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物病毒學(xué)與植物分子遺傳學(xué)；E-mail：69825983@qq.com