趙巧玲 刁秀楠 郭春絨 趙晉忠 杜維俊 岳愛琴

（山西農業(yè)大學，太谷 030801）

山西大豆皂苷類型及其關鍵酶基因表達分析

趙巧玲 刁秀楠 郭春絨 趙晉忠 杜維俊 岳愛琴

（山西農業(yè)大學，太谷 030801）

大豆皂苷Aa、Ab的含量影響大豆制品口感，旨在了解大豆籽粒中皂苷Aa和Ab的組成及含量，進而研究其合成代謝機制。采用HPLC-ESI-MS/MS技術測定大豆材料中Aa、Ab皂苷的含量，利用qRT-PCR技術研究籽粒發(fā)育過程中GmSg-1基因的相對表達量。結果顯示，68個山西大豆材料種子中Aa型大豆材料胚和子葉中Aa皂苷含量的變異范圍分別為0.41-33.79 mg/g，0.21-8.39 mg/g；Ab型大豆胚和子葉中Ab皂苷的變異范圍分別為0.85-44.96 mg/g，0.26-11.09 mg/g。GmSg-1基因序列有19個SNP多態(tài)性位點，其中10個SNP引起氨基酸變異。Aa、Ab大豆皂苷含量在籽粒發(fā)育過程中呈現先增后減的趨勢，在開花后40-50 d皂苷含量達到最大值，而GmSg-1基因的相對表達量在前期呈現與含量基本相同的趨勢。

大豆；皂苷；GmSg-1

大豆皂苷（Soyasaponin）是大豆生長過程中的一類次生代謝產物［1］。具有許多對人體有益的生理功能［2-5］，因此越來越受到人們的重視。大豆皂苷種類繁多、結構復雜，根據大豆皂苷苷元的不同目前把發(fā)現的54種大豆皂苷［6-8］分為7類：A類、B類、DDMP類、E類、H類、I類和J類皂苷［9-12］。

A類大豆皂苷是以大豆皂醇A為苷元，在其C-3和C-22位各結合一個糖基鏈，根據糖基鏈的不同A類皂苷又可分為Aa、Ab和Ao 3個系列［6，9，12，13］。Aa和Ab系列C-22位上分別連有乙?；咎腔鸵阴；咸烟腔?4］，Ao系列皂苷是不含乙?；腔模?5］。GmSg-1基因編碼Aa和Ab皂苷合成的關鍵酶UGT73F4和UGT73F2（圖1）。A類皂苷C-22位末端糖基乙?；瘯е麓蠖辜捌渲破肺兜揽酀?6］，這嚴重影響其口感。因此，為了改善大豆制品的口感，降低和去除A類皂苷，逐漸成為目前研究的熱點。

本研究采用高效液相色譜-電噴霧離子化串聯質譜聯用技術（High performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandern mass spectrometry，HPLC-ESI-MS/MS）測定68份大豆材料胚和子葉中Aa、Ab皂苷的含量以及籽粒發(fā)育過程中Aa、Ab皂苷的含量，利用qRT-PCR技術研究了籽粒發(fā)育過程中Aa、Ab皂苷合成的關鍵酶基因GmSg-1的表達量，并分析GmSg-1基因DNA序列的多態(tài)性。旨在了解大豆籽粒中大豆皂苷Aa和Ab的合成代謝機制，為降低大豆籽粒中A類皂苷含量以及改良大豆品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選取適宜山西種植的68份大豆材料作為實驗材料，所有材料由山西農業(yè)大學大豆育種室提供。供試大豆材料于2015年種植于山西農業(yè)大學實驗農場，按小區(qū)種植，3次重復。大豆種子成熟后自然晾干，分離胚和子葉，保存用于檢測大豆皂苷。

開花期對晉豆52、晉遺30、千斤豆、武黑、中黃13、L-6開花時間相同且在同一部位的花進行掛牌標記，分別取開花后25、32、40、50、60和70 d的大豆莢，每莢取兩粒大豆籽粒，其中一粒用于大豆皂苷的測定，低溫冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆?。另一粒用于基因表達分析，并立即將籽粒于液氮中冷凍，于-80℃保存?zhèn)溆?。每個時期取材均3次重復。

1.2 方法

1.2.1 Aa、Ab皂苷含量的測定 參考岳愛琴等［17］測定大豆皂苷的方法，采用HPLC-ESI-MS/MS測定不同大豆材料胚和子葉中Aa、Ab皂苷的含量。

圖1 Aa和Ab皂苷合成途徑

1.2.2 GmSg-1基因的獲得和測序 采用CTAB法提取材料基因組DNA，使用BioPhotometer D30核酸蛋白測定儀測定DNA的濃度和質量，將DNA稀釋至20 ng/μL供后續(xù)實驗使用。用Primer Premier 5軟件，參照NCBI公布的GmSg-1序列（AB628091），設計引物F1/R1（F1：5′-ATGGGGTCTCTTGTCATCTTCA -3′；R1：5′-TTTAGAGAACAAAAGAAGGCGTAGT-3′）。以材料基因組DNA為模板，用PCR擴增目標片段。PCR體系總體積15 μL，其中DNA模板（20 ng/μL）2.1 μL、5×buffer 3.0 μL、正反引物各0.3 μL（10 μmol/L）、dNTP（2.5 μmol/L）0.4 μL、TransStart?Fast Pfu 0.3 μL和ddH2O 8.6 μL。PCR程序：95℃ 5 min；95℃ 1 min，57℃ 45 s，72℃ 1 min 48 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min，15℃保存。用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測PCR產物，對單一目標條帶進行割膠回收，送上海生工進行測序。

表1 不同品種大豆的分類

1.2.3 目標基因DNA序列單核苷酸多態(tài)性分析 利用DNAStar軟件分析GmSg-1序列的基因多態(tài)性位點。

1.2.4 qRT-PCR檢 測GmSg-1基 因表 達 利 用Trizol法［18］提取RNA，TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金）試劑盒轉錄cDNA。利用Primer Premier 5.0軟件設計目標片段長度為100 bp左右的qRT-PCR引物F2/R2（F2：5′-TCCTGGGCGGATGACG-3′；R2：5′-CGGAATGGAGTTCGGGG-3′），選擇CYP2基因作為內參基因（引物F3：5′-CGGGACCAGTGTGCTTCTTCA-3′；R3：5′-CCCCTCCACTACAAAGGCTCG-3′）。反應總體積為10 μL，含SYBR Premix Ex Taq II 5 μL，引物各1 μL（10 μmol /L），cDNA模板1 μL（100 ng/μL）和RNase Free water 3 μL。qRT-PCR程序為：95℃ 30 s；95℃ 5 s；58℃ 15 s，40次循環(huán)，每個循環(huán)采集一次信號；完成以上步驟后，65℃ 5 s；完成最后的熒光信號采集，3次重復。

2 結果

2.1 大豆皂苷組成多態(tài)性分析

對山西68份大豆材料種子中的大豆皂苷組成進行多態(tài)性分析，分為Aa型、Ab型、AaAb型3種類型（圖2），所占比例分別為51.5%、44.1%和4.4%，說明本試驗山西大豆材料大豆皂苷類型主要為Aa型和Ab型。其中35份大豆材料為Aa型，30份大豆材料為Ab型，3份大豆材料（晉大47、SNWS285、中黃42）為AaAb型（表1）。

2.2 不同類型大豆材料Aa、Ab皂苷含量分析

采用HPLC-ESI-MS/MS法分別測定了不同大豆材料胚和子葉中Aa、Ab皂苷的含量，結果（表2）表明，不同大豆籽粒中Aa、Ab皂苷含量相差較大，Aa型大豆材料胚和子葉中Aa皂苷含量的變異范圍分別為0.41-33.79 mg/g和0.21-8.39 mg/g，Ab型大豆材料胚和子葉中Ab皂苷含量的變異范圍分別為0.85-44.96 mg/g和0.26-11.09 mg/g。胚中Aa或Ab皂苷含量均高于子葉。

表2 大豆胚和子葉中Aa、Ab皂苷含量分析（mg·g-1）

圖2 三種類型大豆的HPLC-ESI-MS/MS譜圖

2.3 籽粒不同發(fā)育時期大豆皂苷含量的分析

采用HPLC-ESI-MS/MS法分別對3種Aa型（武黑、中黃13、L-6）、3種Ab型（晉豆52、晉遺30、千斤豆）大豆材料籽粒不同發(fā)育時期Aa和Ab皂苷含量進行測定。結果（圖3）表明，Aa型和Ab型大豆籽粒中Aa、Ab皂苷含量均在開花后40-50 d達到最大值，之后隨著大豆的成熟，大豆皂苷含量降低，總體呈先增后減的變化趨勢。

2.4 GmSg-1基因的多態(tài)性分析

從NCBI得知，GmSg-1基因位于染色體7 -NC_016094.2，開放性閱讀框為1383 bp，測序結果與cDNA進行比對結果表明該序列沒有內含子。用GmSg-1基因特異性引物F1/R2對5種Aa型、5種Ab型大豆材料的GmSg-1基因進行擴增，電泳結果顯示10個材料均在1 800 bp左右有單一條帶（圖4）。對測序所得DNA序列進行比對，結果（表3和圖5）表明GmSg-1a和GmSg-1b基因共有19個SNP位點差異，其中10個SNP位點引起氨基酸變異，其余9個SNP為同義突變。

2.5 不同發(fā)育時期GmSg-1基因相對表達量分析

對晉遺30不同發(fā)育時期籽粒中GmSg-1基因的表達進行分析，結果（圖6）表明，GmSg-1和CYP2基因的溶解曲線峰值單一，引物的特異性好，所得實驗數據可靠。GmSg-1基因相對表達量在開花后25、32、40、50、60 d呈現先增后減的趨勢，開花后70 d時相對表達量變高（圖7）。開花后40 d GmSg-1基因相對表達量顯著高于25 d和32 d，開花后50 d、60 d表達量顯著降低。GmSg-1基因相對表達量變化趨勢與籽粒皂苷含量變化趨勢基本一致（圖3），最后一個時期GmSg-1基因相對表達量與皂苷含量變化趨勢不一致，可能是其他基因調控所致，還有待進一步研究。

圖3 不同發(fā)育時期籽粒大豆皂苷含量分析

3 討論

大豆皂苷是大豆發(fā)育過程中的一種重要次生代謝產物［1］，具有許多對人體有益的生理功能［2-5］。目前發(fā)現大豆皂苷由54種皂苷組成［8］，其中A類皂苷中Aa、Ab皂苷C-22位末端糖基乙?；菍е麓蠖辜捌渲破肺兜揽酀闹饕颍?，14］。A 類皂苷缺失的大豆材料其大豆制品口感較好［13］。前人研究表明大豆皂苷在不同大豆種質材料中具有豐富的遺傳變異［19］。因此，對大豆種質資源的皂苷組成和含量進行研究，不斷篩選出皂苷組成和含量特異材料，不僅可以用于大豆皂苷的代謝機制研究，還可以用于大豆皂苷品質的遺傳改良。本研究利用HPLCESI-MS/MS對具有代表性的68份山西大豆材料種子中大豆皂苷組成進行多態(tài)性分析，發(fā)現供試材料分為Aa、Ab、AaAb 3種類型，并且主要為Aa和Ab型。Takahashi等［20］對我國3 731份野生大豆資源大豆皂苷類型進行鑒定，結果也表明Aa 型和Ab 型為主要類型，同時他們發(fā)現了一份Aa和Ab皂苷均缺失的Ao類型野生大豆材料。本研究供試材料中未發(fā)現Ao類型，但研究發(fā)現Aa和Ab皂苷含量存在較大的變異范圍，Aa和Ab皂苷含量低的大豆材料可用于今后改良大豆皂苷品質的改良。

圖4 GmSg-1基因PCR結果檢測

表3 GmSg-1基因的多態(tài)性位點

圖5 Aa型、Ab型大豆GmSg-1基因序列比對

圖6 目標基因的溶解曲線

圖7 晉遺30不同發(fā)育時期表達量分析

通過研究不同品種大豆籽粒中Aa、Ab皂苷含量以及大豆籽粒成熟過程中皂苷Aa、Ab的積累和GmSg-1基因的表達量發(fā)現，參試大豆材料籽粒胚和子葉中Aa、Ab皂苷變異范圍大，說明我國擁有的大豆資源Aa、Ab皂苷變異豐富，對今后研究大豆皂苷品質育種工作具有重要意義。

本研究對晉遺30大豆籽粒不同發(fā)育時期的GmSg-1基因相對表達量進行研究，結果表明GmSg-1基因表達量呈現先增后減的趨勢，與其Ab含量的變化趨勢基本一致。但GmSg-1基因在大豆開花后70 d 籽粒中表達量達到最大，這可能說明是GmSg-1基因是大豆皂苷Aa、Ab合成的關鍵酶基因，但是大豆皂苷Aa、Ab合成過程中是否還有其他基因調控，仍有待于進一步研究。

4 結論

本研究發(fā)現，68個品種大豆中Aa型大豆胚和子葉中Aa皂苷的變異范圍分別是0.41-33.79 mg/g，0.21-8.39 mg/g；Ab型大豆胚和子葉中Ab皂苷的變異范圍分別是0.85-44.96 mg/g，0.26-11.09 mg/g。大豆不同發(fā)育時期籽粒Aa、Ab皂苷含量呈現先增后減的趨勢，在開花后40-50 d皂苷含量達到最大值。測序發(fā)現Aa、Ab型大豆材料GmSg-1基因共有19個SNP多態(tài)性位點，其中10個SNP引起氨基酸變異。對不同發(fā)育時期表達量進行分析，發(fā)現變化趨勢呈先增后減，與皂苷含量變化趨勢基本一致。

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（責任編輯 朱琳峰）

Type Analysis of Saponin and Gene Expression of Key Enzyme in Shanxi Soybeans

ZHAO Qiao-ling DIAO Xiu-nan GUO Chun-rong ZHAO Jin-zhong DU Wei-jun YUE Ai-qin
（Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）

The contents of soysaponin Aa and Ab determine the taste of soybean products，this study aims to understand the composition and content of Aa and Ab soysaponin in soybean seeds，and then to study the mechanism of anabolism and synthesis. HPLC-ESI-MS/MS was employed to measure the contents of Aa and Ab saponins in soybean，and qRT-PCR technique to study the relative expression of GmSg-1 gene in grain accumulation. Results showed among 68 Shanxi soybean seeds，the range of Aa saponin variation were 0.41-33.79 mg/g and 0.21-8.39 mg/g in hypocotyls and cotyledons respectively for Aa type soybean materials；and the range of Ab saponin variation were 0.85-44.96 mg/ g and 0.26-11.09 mg/g for Ab type soybean materials. There were 19 SNP variants in GmSg-1 gene，and 10 of them resulting in amino acid substitutions were detected. The contents of Aa and Ab soysaponin increased at first and then decreased in the process of accumulation，and the contents of soysaponin were the highest after blossoming 40-50 d，while the relative expression of GmSg-1 gene was basically in the same trend as the content of soysaponin.

soybean；saponin；GmSg-1

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0395

2017-05-15

國家自然科學基金項目（31171580），山西省自然科學基金項目（201601D011076），山西省高等學?？萍紕?chuàng)新項目（2015148），山西農業(yè)大學中青年拔尖創(chuàng)新人才支持計劃（201203），山西農業(yè)大學引進人才科研啟動費（dwj）

趙巧玲，女，碩士研究生，研究方向：大豆品質研究；E-mail：1009495213@qq.com

岳愛琴，女，副教授，研究方向：大豆品質育種；E-mail：yueaiqinnd@126.com