韓英英 陳福祿 傅永福 張曉玫

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程農(nóng)業(yè)部北京大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

大豆GmCOL1和GmCOL13啟動(dòng)子和基因組基因的克隆與生物信息學(xué)分析

韓英英 陳福祿 傅永福 張曉玫

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程農(nóng)業(yè)部北京大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

以大豆天隆1號(hào)為材料提取基因組DNA，分別克隆到長2 631 bp的 GmCOL1啟動(dòng)子和2 809 bp的GmCOL13啟動(dòng)子。此外，還克隆到GmCOL1和GmCOL13基因組基因長度分別為3 488 bp和2 798 bp，它們分別編碼含348個(gè)和366個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。利用PlantCARE分析GmCOL1和GmCOL13的啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)，它們均含有以下調(diào)控元件：生物鐘元件（Circadian）、光響應(yīng)元件（ACEG-box等）、ABA響應(yīng)元件（ABRE）、干旱誘導(dǎo)元件（MBS）、低溫響應(yīng)元件（LTR）。ProtParam分析表明，GmCOL1和GmCOL13蛋白質(zhì)的分子量分別為38.47 kD和40.91 kD，并且都是親水性蛋白。GOR分析顯示，GmCOL1和GmCOL13的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有Alpha helix，Extended strand和Random coil。在線網(wǎng)站PROSITE的分析說明，GmCOL1和GmCOL13有兩個(gè)Zinc finger B-box和一個(gè)CCT domain（CO，CO-LIKE and TOC1 domain）結(jié)構(gòu)域。

大豆；GmCOL1；GmCOL13；基因克??；生物信息學(xué)分析

種子萌發(fā)、營養(yǎng)生長、開花、受精、胚胎發(fā)育、種子形成等一系列發(fā)育事件構(gòu)成了高等植物的生活周期，其中成花轉(zhuǎn)變是指營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換的過程。成花轉(zhuǎn)變過程由植物自身遺傳因子和外界環(huán)境因素兩方面共同決定，受錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控。近年來利用分子遺傳學(xué)方法對擬南芥等植物開花突變體進(jìn)行研究表明，植物中存在5條主要的開花促進(jìn)途徑：光周期途徑（Photoperiod pathway）、春化途徑（Vernalization pathway）、赤霉素途徑（GA pathway）、自主途徑（Autonomous pathway）和年齡途徑（Aging pathway）［1，2］，其中光周期途徑是目前為止研究得較為清楚的一條途徑。研究表明，CO（CONSTANS）是光周期途徑中的關(guān)鍵基因［3，4］，它位于光受體下游和生物鐘的輸出途徑，是生物鐘和開花時(shí)間基因之間監(jiān)測日照長度的重要元件，它可以整合光信號(hào)和生物鐘信號(hào)［5，6］，并激活下游基因FT（FLOWERING LOCUS T）基因的表達(dá)從而誘導(dǎo)植物開花［7］。因此，CO基因的突變導(dǎo)致植物晚花［8，9］。

在長日照植物擬南芥中，CO的表達(dá)模式在很大程度上受到生物鐘基因FKF1（FLAVIN-BINDING，KELCH REPEAT，F(xiàn)-BOX1）、GI（GIGANTEA） 和CDF（CYCLING DOF FACTOR）） 的 調(diào) 控［3，10-12］。在早晨，CDF和GI形成的復(fù)合體會(huì)結(jié)合在CO的啟動(dòng)子區(qū)從而抑制CO的轉(zhuǎn)錄；而在傍晚，F(xiàn)KF1和 GI會(huì)形成蛋白復(fù)合體去降解CDF蛋白［10，11］。CO蛋白在傍晚通過光穩(wěn)定，并在早晨或在黑暗中降解［13］。在早晨，光敏色素B（PHYB）促進(jìn)CO蛋白的降解，而PHYA和隱花色素（CRY1和CRY2）在LD條件的下午穩(wěn)定CO蛋白［13-15］。SPA1（Suppressor of phya proteins）、SPA3和 SPA4和COP1（Constitutivephotomorphogenesis 1）復(fù)合物在夜間降解CO蛋白［16-18］。HOS1（High expression of osmotically responsive genes 1）也在上午負(fù)調(diào)節(jié)CO蛋白［19］。

在逆境下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。1-Pyrroline-5-carboxylate synthase（P5CS）酶是調(diào)控脯氨酸合成的限速步驟，在擬南芥中有兩個(gè)編碼P5CS的基因：AtP5CS1和AtP5CS2［20］。ACS10（ACC SYNTHASE 10）是乙烯合成的關(guān)鍵酶。CO基因的過表達(dá)促進(jìn)AtP5CS2和ACS10基因的表達(dá)［7］，說明CO基因可能參與植物抗逆的調(diào)節(jié)。

本研究克隆大豆GmCOL1和GmCOL13啟動(dòng)子以及基因組基因（包含5′和3′非翻譯區(qū)、完整的外顯子、內(nèi)含子和終止子），并通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測啟動(dòng)子和基因編碼蛋白所含的功能元件，為進(jìn)一步研究基因的功能提供基本材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 大豆品種天隆1號(hào)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院武漢油料所周新安老師惠贈(zèng)。種植在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所溫室中，培養(yǎng)條件為長日（16 h光照/8 h黑暗），光照強(qiáng)度為100-300 μmol/（m2·s），溫度為恒定25℃。

1.1.2 菌株和載體 實(shí)驗(yàn)中所用大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；啟動(dòng)子入門載體Fu76、基因入門載體 Fu79及表達(dá)載體Fu39-2-GUS［21］為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶購自NEB；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase購自TaKaRa；DNA Ligation Kit Ver.2.1購 自TaKaRa；普 通Taq DNA polymerase購自北京澤星生物科技有限公司；基因組DNA提取試劑盒購天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 啟動(dòng)子的克隆及載體構(gòu)建 參照天根植物基因組DNA提取試劑盒提取大豆天隆1號(hào)基因組DNA。根據(jù)Phytozome網(wǎng)站上Glycine max Wm82.a2.v1數(shù)據(jù)庫中Glyma08g28370（GmCOL1）和Glyma19g05170（GmCOL13）的基因組序列設(shè)計(jì)引物（表1）。選取5′ UTR上游3 kb作為啟動(dòng)子。以大豆天隆1號(hào)全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系：2×PrimeSTAR GC Buffer 25 μL，dNTP Mixture 4 μL，正反向引物各1 μL（10 μmol/L），模板0.5 μL（200-400 ng），PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，用滅菌水補(bǔ)足至50 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物?；厥誔CR 產(chǎn)物，與Fu76載體連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，通過菌落PCR 鑒定陽性克隆。陽性克隆委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，序列測序正確的質(zhì)粒通過LR 反應(yīng)到表達(dá)載體Fu39-2-GUS，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，通過菌落PCR 鑒定陽性克隆。陽性克隆委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 基因的克隆及載體構(gòu)建 提取基因組DNA、PCR反應(yīng)程序、以及菌液PCR檢測過程見方法1.2.1。我們將3′ UTR下游1 kb作為終止子，引物見表1。

表1 所用引物列表

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用PlantCARE（http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）分析啟動(dòng)子元件。通過ProtParam（http://web.expasy.org/ protparam/）分析蛋白質(zhì)的分子量、分子式、等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、半衰期、平均親水系數(shù)以及氨基酸組成。ProtScale 程序（http://web.expasy. org/protscale）進(jìn)行疏水性分析。通過SingalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP） 分 析 蛋 白質(zhì)中的信號(hào)肽。用TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM）分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)。通過NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos）預(yù)測磷酸化位點(diǎn)。通過在線的PROSITE（http://prosite.expasy.org）進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析。通過在線的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站GOR（https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4. html）分析二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過STRING（http://string-db. org）推測與可能與GmCOL1或GmCOL13有直接或間接相互作用的蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 基因的克隆

2.1.1 大豆GmCOL1和GmCOL13啟動(dòng)子的克隆 根據(jù)Phytozome網(wǎng)站上Glycine max Wm82.a2.v1數(shù)據(jù)庫中Glyma08g28370（COL1）和Glyma19g05170（COL13）的基因組序列設(shè)計(jì)引物。選取5′ UTR上游3 kb作為啟動(dòng)子，以大豆天隆1號(hào)全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約3 kb的條帶（圖1）。將擴(kuò)增得到的目的片段連接在Fu76載體，并進(jìn)行測序，測序結(jié)果得到的GmCOL1為2 631 bp，GmCOL13為2 809 bp。它們分別與Glycine max Wm82.a2.v1中的Glyma08g28370和Glyma19g05170序列一致。

圖1 GmCOL1和GmCOL13的啟動(dòng)子擴(kuò)增

圖2 GmCOL1和GmCOL13的啟動(dòng)子元件分析

2.1.2 大豆GmCOL1和GmCOL13的啟動(dòng)子元件分析 將擴(kuò)增得到的序列在PlantCARE中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GmCOL1和GmCOL13的啟動(dòng)子區(qū)均含有以下重要元件：Circadian（生物鐘元件）；光響應(yīng)元件（ACE，G-box等）；ABA響應(yīng)元件（ABRE）；干旱誘導(dǎo)元件（MBS）；LTR（低溫響應(yīng)元件）。其中GmCOL13還含有GA響應(yīng)元件（GARE，P-box和 TATC-box），表明GmCOL1和GmCOL13可能受到生物鐘、ABA和干旱的影響，GmCOL13還會(huì)受到GA的影響。擬南芥AtCO的啟動(dòng)子元件中也含有Circadian、光響應(yīng)元件、ABA、干旱誘導(dǎo)元件、GA響應(yīng)元件，不包括LTR。說明GmCOL1和GmCOL13和擬南芥AtCO的啟動(dòng)子元件基本一致（圖2，表1）。2.1.3 大豆GmCOL1和GmCOL13基因組基因（gDNA）擴(kuò)增 根據(jù)Phytozome網(wǎng)站上Glycine max Wm82.a2.v1數(shù)據(jù)庫中Glyma08g28370（GmCOL1）和Glyma19g05170（GmCOL13）的基因組序列設(shè)計(jì)引物。我們將gDNA分成兩部分，第一部分為5′ UTR+編碼區(qū)；第二部分為3′ UTR+終止子。在這兩部分之間分別插入3xHA和3xFLAG標(biāo)簽，用于后續(xù)試驗(yàn)中蛋白表達(dá)分析。將序列與Fu79連接進(jìn)行測序，測序得到GmCOL1的5′ UTR+編碼區(qū)為2 559 bp，3′UTR+終止子為928 bp；GmCOL13的5′ UTR+編碼區(qū)為2 115 bp，3′ UTR+終止子為682 bp（圖3）。測序結(jié)果與Glycine max Wm82.a2.v1中的序列基本一致，個(gè)別堿基差異之處由品種間差異所致，表明克隆得到的基因是大豆天隆1號(hào)中的COL基因。

圖3 GmCOL1和GmCOL13的基因組DNA擴(kuò)增

2.2 大豆GmCOL1和GmCOL13蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.2.1 大豆GmCOL1和GmCOL13蛋白質(zhì)的氨基酸組成及親疏水性分析 GmCOL1編碼348個(gè)氨基酸。ProtParam分析結(jié)果（表2）表明，該蛋白質(zhì)的分子量為38.47 kD，分子式為C1670H2569N489O525S18，等電點(diǎn)為5.88；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為45個(gè)，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為34個(gè)；脂肪系數(shù)為67.04；不穩(wěn)定系數(shù)為28.46，此蛋白為穩(wěn)定蛋白（標(biāo)準(zhǔn)40 以下為穩(wěn)定蛋白）；理論推導(dǎo)半衰期大約為30 h；平均親水系數(shù)為-0.434。在GmCOL1蛋白的氨基酸組成中，含量較高的氨基酸有：Ala（10.9%）、Ser（8.9%）、Val（7.8%）、Arg（6.0%）。

GmCOL13編碼的氨基酸有366個(gè)，ProtParam分析結(jié)果（表2）表明該蛋白質(zhì)的分子量為40.91 kD，分子式為C1775H2736N508O563S22，等電點(diǎn)為5.47；帶負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為52，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為38；脂肪系數(shù)為65.77；不穩(wěn)定系數(shù)為47.50，此蛋白為不穩(wěn)定蛋白；理論推導(dǎo)半衰期大約為30 h；平均親水系數(shù)為-0.507。在GmCOL13蛋白的氨基酸組成中，含量較高的氨基酸有：Ala（10.9%）、Ser（8.9%）、Val（7.8%）。

用ProtScale 在線工具進(jìn)行疏水性分析（圖4），同樣可得出這兩個(gè)蛋白為親水性蛋白。

表2 GmCOL1和GmCOL13的氨基酸含量

2.2.2 大豆GmCOL1和GmCOL13的信號(hào)肽、跨膜區(qū)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 通過SingalP4.1分析發(fā)現(xiàn)GmCOL1和GmCOL13的蛋白質(zhì)中沒有信號(hào)肽。用TMHMM2.0分析GmCOL1和GmCOL13的蛋白質(zhì)也不存在跨膜區(qū)。通過NetPhos 3.1 Server預(yù)測GmCOL1和GmCOL13含有廣泛的磷酸化位點(diǎn)（圖5）。表明GmCOL1和GmCOL13會(huì)受到磷酸化修飾，從而影響其活性。

圖4 GmCOL1（A）和GmCOL13（B）的氨基酸疏水性分析

2.2.3 不同物種中COL的進(jìn)化樹分析 分別用COL1和COL13的蛋白質(zhì)序列通過UniProt的BLAST查找大豆、木豆、苜蓿、豌豆、可可、煙草、擬南芥、馬鈴薯、水稻、玉米、二穗短柄草和小麥的同源基因，然后通過MEG6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖6）表明，GmCOL1和GmCOL13與其他豆科植物的CO（如MtCOLa、PsCOLa、CaCOL2）親緣關(guān)系較近。

2.2.4 大豆GmCOL1和GmCOL13的功能結(jié)構(gòu)域分析 通過在線的PROSITE進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)GmCOL1和GmCOL13均有兩個(gè)Zinc finger B-box和一個(gè)CCT domain，且所在的位置也類似（圖7）。Zinc finger B-box是一個(gè)大約有40個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域，它通常存在于轉(zhuǎn)錄因子、核糖核蛋白類和原癌基因蛋白類。但是這個(gè)結(jié)構(gòu)域并沒有詳細(xì)的功能研究。CCT（CONSTANS，CO-like，and TOC1）domain是大約43個(gè)氨基酸的高度保守的基本元件，存在于參與光信號(hào)誘導(dǎo)的植物蛋白的C端，并且會(huì)與其他結(jié)構(gòu)域互作，例如B-box zinc finger、GATA-type zinc finger和ZIM motif或相應(yīng)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。已有研究表明CCT domain參與核定位，也可能參與蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的互作。

圖5 GmCOL1和GmCOL13的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

GmCOL1在N端有兩個(gè)Zinc finger B-box，分別位于第10-54位（TWARMCDTCRSAPSSVFCRAHTAF LCATCDARLHASLTWHERVWV）和第50-97位氨基酸（ERVWVCEACERAPAAFLCKADAASLCASCDADI HAANPLASRHHRVPI）；C端有一個(gè)CCT domain，在第279-321位氨基酸（REARVLRYREKKKTRKFEKT IRYASRKAYAETRPRIKGRFAKR）。GmCOL13的兩個(gè)Zinc finger B-box分別位于第17-64位（TWSRVCDTC LSAPCVLYCHADSAYLCSSCDARVHAANRVASRHKRV WV）和第60-107位氨基酸（KRVWVCEACERAPAAF LCKADAASLCSSCDADIHSANPLASRHNRVPI）；C端有一個(gè)CCT domain，位于第297-339位氨基酸（REA RVLRYREKKKTRKFEKKIRYASRKAYAETRPRIKGRFAKR）。

圖6 GmCOL1和GmCOL13蛋白質(zhì)的進(jìn)化樹分析

圖7 GmCOL1和GmCOL13的結(jié)構(gòu)域示意圖

2.2.5 大豆GmCOL1和GmCOL13的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 通過在線二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站GOR的分析（圖8）表明，GmCOL1和GmCOL13的二級(jí)結(jié)構(gòu)只存在Alpha helix（Hh）、Extended strand（Ee）和Random coil（Cc）。GmCOL1中 分 別 有73個(gè)Alpha helix（20.98%），64個(gè)Extended strand（18.39%） 和211個(gè)Random coil（60.63%）；GmCOL13中分別有92個(gè)Alpha helix（25.14%），67個(gè)Extended strand（18.31%）和207個(gè)Random coil（56.56%）。

2.2.6 大豆GmCOL1和GmCOL13的蛋白質(zhì)互作關(guān)系預(yù)測 在擬南芥中，CO的轉(zhuǎn)錄水平高低與FLAVIN-BINDING、KELCH REPEAT、F-BOX 1（FKF1）-GIGANTEA（GI）復(fù)合物的量緊密相關(guān)。這個(gè)復(fù)合物以藍(lán)光依賴的方式通過泛素蛋白酶體降解CO轉(zhuǎn)錄抑 制 物CYCLINGDOF FACTORs（CDFs）［3，10，11］。GI也會(huì)直接結(jié)合在CO的啟動(dòng)子區(qū)，而當(dāng)GI與EARLY FLOWERING 4（ELF4）互作時(shí)會(huì)離散核體進(jìn)而影響CO的表達(dá)水平［22］。以上研究表明CO與GI能夠通過直接或間接方式互作。

CO蛋白質(zhì)的降解方式主要是通過E3泛素連接酶介導(dǎo)的泛素化，而SCF復(fù)合體的泛素化活性依賴于其4個(gè)組成成分：RBX1、Skp1-like、cullin和F-box蛋白。此外，cullin必須經(jīng)過結(jié)合RUB/NEDD8泛素化來修飾后才能具有活性［23］。綜上所述，NEDD8通過直接或間接方式與CO互作進(jìn)而使CO蛋白降解。

本研究通過STING推測可能與GmCOL1或GmCOL13有直接或間接相互作用的蛋白質(zhì)（圖9）。 如GmGIa（GIGANTEA） 和GmGIL1（Glyma20G170000），通過光周 期 調(diào)控開花；Glyma01G41590和Glyma11G03840是 含 有 ELYS domain，具有泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性；Glyma02G43540和Glyma14G05430是含有RING和WD40結(jié)構(gòu)域，具有泛素蛋白連接酶活性；LFY（Glyma04G37900）是 含 有FLO-LFY domain（Floricaula/leafy protein），它調(diào)控轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)開花時(shí)間；Glyma05G15210和Glyma19G22450含有PINT domain，是COP9信號(hào)小體的組成成分，參與泛素依賴的蛋白催化過程和deneddylation（neddylation是一種新型的類泛素化修飾）。通過與這些蛋白質(zhì)的相互作用，GmCOL1和GmCOL13可能參與光周期開花途徑、泛素化修飾以及neddylation。

圖8 GmCOL1和GmCOL13的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

圖9 GmCOL1或GmCOL13與大豆中其他蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系圖

3 討論

CO在擬南芥開花調(diào)節(jié)的光周期響應(yīng)機(jī)制中具有主要作用。啟動(dòng)子區(qū)有許多調(diào)控元件，通過分析這些元件可以預(yù)測基因受哪些外界條件誘導(dǎo)，可能受哪些調(diào)控因子的調(diào)控。本研究中分析了GmCOL1和GmCOL13的啟動(dòng)子元件，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因可能受生物鐘調(diào)控。前期工作表明，GmCOL1的表達(dá)峰值在黎明，此后直到傍晚表達(dá)量一直很低；在短日條件下，GmCOL13的表達(dá)峰值在ZT12，長日條件下有兩個(gè)表達(dá)峰，一個(gè)在ZT4另一個(gè)分別在ZT12和ZT16［24］。本研究還發(fā)現(xiàn)，GmCOL1和GmCOL13的啟動(dòng)子還受ABA、干旱以及低溫的影響，GmCOL13還可能受到GA的影響。

GmCOL1蛋白質(zhì)較穩(wěn)定，這個(gè)物理性質(zhì)不同于擬南芥CO；而GmCOL13則是不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，與擬南芥CO類似。擬南芥CO蛋白的穩(wěn)定性受到一些光受體的影響，在傍晚通過一些藍(lán)光受體使其穩(wěn)定，而在早晨或在黑暗中被降解［13］。

通過進(jìn)化樹分析，GmCOL1和GmCOL13與豆科植物的MtCO、StCO的同源關(guān)系較近。在擬南芥中，盡管AtCOL1和AtCOL2與AtCO的氨基酸序列高度相似，但是AtCOL1和AtCOL2都與光周期開花沒有關(guān)系［25］。MtCOLa對開花沒有影響［26］。StCO對開花時(shí)間的影響也很弱［27］。因此，GmCOL1和GmCOL13對大豆的光周期開花調(diào)節(jié)的功能有待進(jìn)一步研究。

GmCOL1和GmCOL13有多個(gè)位點(diǎn)能夠被磷酸化，表明這兩個(gè)蛋白質(zhì)的活性可能會(huì)受到磷酸化的影響。蛋白質(zhì)磷酸化也是一種翻譯后修飾方式，這個(gè)過程影響轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性和活性［28］。有研究表明，磷酸化會(huì)影響黑暗和光照條件時(shí)AtCO蛋白的穩(wěn)定性，從而與光周期開花調(diào)節(jié)相關(guān)［29］。

STRING互作分析表明，GmCOL1和GmCOL13可能與開花基因GI和LFY互作，從而調(diào)節(jié)大豆開花。而且GmCOL1和GmCOL13蛋白可能與泛素修飾及neddylation（一種新型的類泛素化修飾），說明GmCOL1和GmCOL13蛋白代謝調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過程。

4 結(jié)論

本研究分別克隆到了GmCOL1和GmCOL13的啟動(dòng)子和基因組基因，其序列在天隆1號(hào)和Williams沒有明顯差異。GmCOL1和GmCOL13基因的表達(dá)可能受到生物鐘、干旱和低溫的影響，GmCOL13的表達(dá)還可能受到GA的影響。GmCOL1可能不參與調(diào)控光周期開花，但是GmCOL13基因可能參與植物生物鐘節(jié)律途徑。GmCOL1和GmCOL13的蛋白質(zhì)代謝可能與磷酸化、泛素化及neddylation有關(guān)。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Cloning and Bioinformatics Analysis of Promoters and Genomic Genes of GmCOL1 and GmCOL13 in Soybean

HAN Ying-ying CHEN Fu-lu FU Yong-Fu ZHANG Xiao-mei
（MOA Key Lab of Soybean Biology（Beijing），National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement，Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

In the present study，the promoters and genomic genes of GmCOL1 and GmCOL13 were cloned from soybean cultivar Tianlong 1. The lengths of GmCOL1 and GmCOL13 promoters were 2 631 bp and 2 809 bp，while their genomic genes were 3 488 bp and 2 798 bp encoding 348 amino acids and 366 amino acids，respectively. Analysis by PlantCARE demonstrated that some important elements in the promoters of both GmCOL1 and GmCOL13：circadian，cis-acting regulatory element involved in light response，cis-acting element involved in ABA response，MYB binding site involved in drought-induction，and cis-acting element involved in low-temperature response. ProtParam analysis showed that GmCOL1 and GmCOL13 proteins were 38.47 kD and 40.91 kD，respectively，and both were hydrophilic. GOR analysis revealed that their secondary structure included mainly alpha helix，extended strand and random coil. Online PROSITE investigation displayed that GmCOL1 and GmCOL13 both had two zinc finger B-boxes and one CCT domain.

soybean；GmCOL1；GmCOL13；gene cloning；bioinformatics analysis

10.13560/J.cnki.biotech.bull.1985.2017-0201

2017-03-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31371703，31570289），轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ?xiàng)（2016ZX08004-005，2016ZX08009001-001）

韓英英，女，碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：hyy747319085@163.com

張曉玫，女，博士，研究方向：植物分子生物學(xué)與基因工程；E-mail：zhangxiaomei@caas.cn