姚 軍， 謝 莉， 陳勝蘭， 張佳麗， 葉心儀， 盧兆杰

茶色素對年輕恒牙牙合面窩溝封堵的對比觀察研究

姚 軍1， 謝 莉2， 陳勝蘭2， 張佳麗1， 葉心儀2， 盧兆杰3

目的 探討應用茶葉有效成分封堵年輕恒牙牙合面的窩溝以預防窩溝齲的可行性。 方法 將36顆離體牙隨機分為6組(n=6)：24 mg/mL的綠茶、白茶、烏龍茶、紅茶溶液組以及1 mg/mL茶色素成品組和窩溝封閉組。除窩溝封閉組，其余5組均將離體牙牙冠分別倒置在上述茶浸出液中，浸泡24 h后，使用立體顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察各組牙齒表面特別是牙合面窩溝處的茶色素吸附情況。 結果 立體顯微鏡下觀察：茶色素組相對于其他種類茶葉組的窩溝處色澤較深，其次為紅茶組、烏龍茶組、白茶組以及綠茶組。掃描電子顯微鏡下觀察：除綠茶組外，其他實驗組窩溝處都有吸附物封堵，各組吸附物厚度經方差分析顯示,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；用LSD檢驗進行各組間兩兩比較，顯示各組間差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結論 牙合面點隙窩溝處的物質與茶色素有關，可以以茶色素為主要研究對象，進一步研究應用茶葉進行物理性封堵窩溝來預防齲病的可行性。

茶葉； 色素類； 齲齒； 窩溝封閉物； 吸附； 顯微鏡檢查，電子，掃描

齲損好發(fā)于牙體咬合面，發(fā)生于窩溝點隙的齲病稱為窩溝齲，具有較大的破壞性[1]。在我國，兒童齲病的發(fā)生率約為50%，其中約80%為窩溝齲[2]。目前，國際上公認最有效的窩溝齲預防方法是窩溝封閉術[3-8]。該封閉術在臨床上運用幾十年，已較為成熟，效果也獲得肯定。但是，窩溝封閉術的操作必須在口腔治療椅上進行，且操作步驟復雜，使其普及率不高。尋找一種操作簡單、對硬件和孩子的配合程度均要求不高、并能有效封堵年輕恒牙窩溝的齲病預防方法是必要的。

茶的成分豐富，含有茶多酚、茶色素(tea pigment,TP)、咖啡堿、氨基酸、生物堿及維生素等對人體有益的成分[9]。根據(jù)陳紹寬的研究，茶的制造方法可以分為不發(fā)酵、輕發(fā)酵、重發(fā)酵以及全發(fā)酵4類[10]。隨著發(fā)酵程度的增加，TP的含量也不斷增加。不發(fā)酵類的綠茶，其主要活性成分為茶多酚，而對于全發(fā)酵類的紅茶，主要活性成分為TP，它是唯一有明顯顏色的物質。TP是從茶葉中提取的一類小分子酚性氧化聚合物，是一種具有極高生物活性的藥用物質，可以從紅茶中直接提取，也可由茶多酚直接氧化獲得[11-12]。TP中的茶黃素易吸附于牙面，其對唾液富組蛋白5最具親和力,可導致較嚴重的牙著色，且能快速沉積到全唾液生物膜表面,并很難去除[13-14]。本實驗針對TP易吸附的特點，使用立體顯微鏡以及掃描電子顯微鏡觀察不同茶類的茶葉浸出液在牙齒窩溝處的吸附情況，探討TP對窩溝封堵的可能作用。

1 對象與方法

1.1 對象 標本來自臨床提供的36顆因正畸治療被拔除的上頜前磨牙，男性18例，女性18例，年齡中位數(shù)14歲(12～16歲)。納入標準：因正畸治療拔除的前磨牙，深窩溝，無齲壞，無明顯磨耗和裂痕。排除標準：非因正畸治療拔除的前磨牙，齲壞，有明顯磨耗和裂痕以及在實驗切割中損壞的標本。

1.2 材料和儀器 綠茶(發(fā)酵程度0%,浙江采云間茶葉有限公司)；白茶(發(fā)酵程度10%，福鼎市天健茶葉有限公司)；烏龍茶(發(fā)酵程度50%，福建日豐生態(tài)茶葉有限公司)；紅茶(發(fā)酵程度100%，武夷山正山茶葉有限公司)；TP(茶黃素含量40%，浙江大學農學院茶學系提供)。電子分析天平(BSA224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；超聲清洗儀(KQ-100TDV，昆山超聲儀器有限公司)；慢速鋸(IsoMet1000，美國標樂公司)；新型真空磁控離子濺射鍍膜儀(Q150R，英國Quorum公司)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Quanta 450 FEG，美國FEI公司)；數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(202.2A型，上海陽光實驗儀器有限公司)；雙目立體顯微鏡(PXS5-B，上海測維光電技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 茶葉浸出液及TP組的制備 無菌條件下，將綠茶、白茶、烏龍茶及紅茶各稱取2.4 g浸泡于100 mL沸騰的蒸餾水中，時間為20 min，濾紙過濾，得24 mg/mL的各茶類茶葉浸出液。在無菌的條件下，用天平精確稱取TP 10 mg與10 mL蒸餾水混勻，配制成1 mg/mL的TP溶液。

1.3.2 分組 將超聲波清洗過的36顆離體牙牙冠朝下倒置，隨機分到24 mg/mL的綠茶組、白茶組、烏龍茶組和紅茶組以及1 mg/mL TP中浸泡24 h，窩溝封閉組則采用常規(guī)的窩溝封閉術。共6組，每組6顆離體牙。

1.3.3 立體顯微鏡下觀察 將以上6組茶葉浸出液浸泡后的標本用去離子水超聲洗滌，干燥后在立體顯微鏡下觀察牙合面窩溝TP的吸附情況。

1.3.4 掃描電子顯微鏡下觀察 各組隨機抽取3個標本進行掃描電子顯微鏡觀察。采用慢速鋸將茶葉浸泡后的標本牙根去除后，再將牙冠按照與窩溝垂直的方向縱向切割成2 mm厚的橫截片，每個標本取3個不同部位的橫截片，共18個。用去離子水超聲洗滌，干燥、噴金后掃描電子顯微鏡下觀察。

2 結 果

2.1 立體顯微鏡下觀察結果 在24 mg/mL相同濃度下，除了綠茶組牙面無明顯TP吸附外，其他組牙面均能見到TP附著現(xiàn)象，且主要附著在牙面的點隙窩溝處,其中紅茶組吸附最明顯，其次為烏龍茶組和白茶組(圖1)。

A：24 mg/mL綠茶組，窩溝處未發(fā)現(xiàn)明顯色素附著； B：24 mg/mL白茶組，窩溝處及其周圍可見較淺的色素附著； C：24 mg/mL烏龍茶組，窩溝處及其周圍可見較深的色素附著； D：24 mg/mL紅茶組，窩溝處及其周圍可見面積較大且較深的色素附著； E：1 mg/mL茶色素組，在牙齒光滑面及窩溝處均可見較深的色素附著； F：窩溝封閉組，在窩溝處可見質地均勻白色不透明的窩溝封閉劑.圖1 立體顯微鏡下觀察各組標本的窩溝茶色素吸附情況( ×10)Fig 1 Stereo microscope on the grooved chewing pigment adsorption of each specimen( ×10)

2.2 窩溝形態(tài)的掃描電子顯微鏡分析 濃度為24 mg/mL的各茶類中，除綠茶組外，其他各組窩溝處都有吸附物封堵窩溝。色素附著厚度(μm)：白茶組(191.72±12.06)，烏龍茶組(368.52±17.90)，紅茶組(669.42±33.92)，TP組(894.37±28.73)，窩溝封閉組(1 016.58±64.76)。各組數(shù)據(jù)經方差分析顯示，差別均有統(tǒng)計學意義(F=540.719,P<0.05)。進一步使用LSD檢驗進行各組間兩兩比較顯示，各組間差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 掃描電子顯微鏡下觀察結果 100倍視野下：各組標本均可見牙釉質與牙本質間有明顯界限，窩溝處于牙釉質區(qū)，形態(tài)細長，深度接近牙本質界。綠茶組的窩溝內未見明顯吸附物；白茶組可見窩溝底部有少量吸附物；烏龍茶組可見窩溝開口處有吸附物封堵；紅茶組可見窩溝開口處有吸附物；TP組可見整個窩溝均有吸附物；后4組的吸附物質與窩溝表面連接較為松散；窩溝封閉組可見窩溝封閉材料幾乎充滿整個窩溝且與窩溝表面緊密連接(圖2)。1 000倍視野下：綠茶組的窩溝內雖未見明顯吸附物，但在窩溝表面有極少量的吸附物；白茶組和烏龍茶組可見吸附物成團塊狀，吸附物可見裂紋且與窩溝表面的連接不夠緊密；而紅茶組吸附物未見裂紋，未能有效封堵整個窩溝；TP組中可見窩溝充滿吸附物，但吸附物有裂紋；窩溝封閉組可見窩溝封閉材料質地致密，充滿整個窩溝且與窩溝表面緊密連接(圖2)。

1：牙釉質； 2：牙本質. A～F：100倍； A1～F1：1 000倍. A,A1：24 mg/mL綠茶組：窩溝處未見附著物；B,B1：24 mg/mL白茶組，窩溝底部見少量松散的附著物；C,C1：24 mg/mL烏龍茶組，窩溝開口處見少量松散的附著物；D,D1：24 mg/mL紅茶組，窩溝開口處見大量附著物；E,E1：1 mg/mL茶色素組，整個窩溝處充滿附著物且附著物內有微小裂紋；F,F1：窩溝封閉術組，整個窩溝處充滿質地均勻且接合緊密的窩溝封閉劑.圖2 掃描電子顯微鏡放大100或1 000倍下觀察各組茶色素吸附情況Fig 2 Observed under SEM magnified 100 or 1 000 times each nest ditch pigment adsorption condition

3 討 論

由于年輕恒牙齲病多發(fā)，且主要發(fā)生在牙齒的窩溝處。若不能采取積極有效的措施加以預防和治療，將可能進一步發(fā)展成為牙髓炎、根尖周炎甚至牙齒缺失，嚴重影響兒童的身心健康[15-17]。因此，預防年輕恒牙齲病成為關注的焦點。目前，防治齲病的主要方法中，以窩溝封閉術最為有效，但因其技術要求較高，較難普及。本研究從長期飲茶導致牙面色素附著且色素不易清除這一現(xiàn)象得到啟發(fā)，猜想是否可將茶葉中的相關成分應用于牙合面點隙窩溝處，從而實現(xiàn)預防窩溝齲的目的。作為TP含量最高的紅茶，在我國資源豐富。近年來研究表明，茶葉中所含的茶多酚、TP及其衍生物能夠抑制多種口腔致病菌[18-19]，其中綠茶所含的主要活性成分茶多酚可減少齲病的發(fā)生[20]，而紅茶中的主要成分TP不僅對葡萄糖基轉移酶催化的胞外多糖-葡聚糖的合成有明顯的抑制作用，而且能夠有效地降低淀粉酶的活性，從而起到比茶多酚更好的抑菌效果[21-23]。

本實驗將離體牙牙冠朝下倒置浸泡于處理液中，從而排除重力作用導致的大分子物質沉積的因素。通過立體顯微鏡觀察不同茶類以及不同濃度的茶葉在窩溝處的吸附情況，可知紅茶的吸附情況較同等濃度的其他茶類效果好。由于紅茶所含TP的濃度較其他茶類的茶葉高，為進一步探索是否與TP在牙合面的吸附有關，本實驗增加了TP組，對比窩溝封閉術、紅茶、TP在牙合面窩溝處的封堵情況，結果顯示，TP在牙合面的吸附情況較紅茶效果好，可在整個窩溝內形成吸附，更好的封堵牙合面窩溝。

雖然在掃描電子顯微鏡下可見吸附物質與窩溝牙釉質處有微小的裂紋，但是這可能與實驗前標本脫水以及掃描電子顯微鏡下高能入射電子束轟擊掃描標本表面，造成TP吸附物質與牙釉質的裂紋有關。在實驗切割、沖洗牙體標本的過程中，其窩溝處TP吸附物并未脫落，足以證明TP在窩溝處吸附牢固。雖然通過實驗對比，可知在牙合面的TP吸附不如傳統(tǒng)窩溝封閉術緊密，但其可作為傳統(tǒng)窩溝封閉術的補充，同時發(fā)揮預防齲病的作用。

本實驗作為一種初期探討，雖然觀察到TP有封堵窩溝的作用，但離實際應用還有距離。例如以下幾個問題：TP在牙面窩溝處吸附不夠致密，與牙面連接不夠緊密；TP在牙合面的吸附產生的棕黑色與齲壞導致的棕黑色相似，易被誤認為是齲壞，如何改變其顏色也是需要考慮的問題;如何使TP在短時間內達到牢固有效的吸附；由于TP純品具有強的口腔收斂作用，在口腔內易產生苦澀感，如何去除也是研究的重點所在。

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(編輯：何佳鳳)

The Study of Tea Pigments to Seal Fissure of Young Permanent Teeth

YAO Jun1, XIE Li2, CHEN Shenglan2, ZHANG Jiali1, YE Xinyi2, LU Zhaojie3

1. Department of Pedodontology, Fujian Medical University School of Stomatology, Fuzhou 350002, China；2. Fujian Medical University School of Stomatology, Fuzhou 350122, China；3. Department of Special Dentistry, Fujian Medical University School of Stomatology, Fuzhou 350002, China

Objective To investigate the active role of different components in tea in caries prevention. Methods 36 isolated teeth were randomly assigned to 6 groups. Each group had 6 teeth: 24 mg/mL green tea group, 24 mg/mL white tea group, 24 mg/mL oolong tea group, 24 mg/mL black tea group, 1 mg/mL tea pigment group, and dental sealant group. The isolated teeth were immersed in the assigned liquid for 24 h. Using stereo microscope and scanning election microscope(SEM) we evaluated the pigmentation on the tooth surface. Results Tea pigments group showed better in the sealing than the other tea groups, but no more than dental sealant group. The green tea had no adsorption at the fissure by SEM observing. Among the different groups the result was statistically significant(F=540.719,P<0.05). With LSD test comparison between two groups each time, it was shown that there was statistical difference between groups(P<0.05). The high concentration of black tea group showed better sealing result. Conclusions The effect of high concentration of black tea is the best. Substance observed at the fissure is related to tea pigment, therefore we think that tea pigments can be of field of interest for the prevention of dental caries.

folium camelliae; pigments; dental caries; pit and fissure sealants; adsorption; microscopy, electron, scanning

2016-09-21

福建省衛(wèi)生廳中青年骨干人才培養(yǎng)項目(2013-ZQN-ZD-22)

福建醫(yī)科大學 1.附屬口腔醫(yī)院 兒童牙科，福州 350002；2.口腔醫(yī)學院，福州 350122；3.附屬口腔醫(yī)院特診科，福州 350002

姚 軍，男，主任醫(yī)師，齒學博士. Email: dentyao@163.com

R282.71； R348.6； R780.1； R781.1； R977.7

A

1672-4194(2017)02-0121-05