陳 勇

星形膠質細胞與GnRH神經元共培養(yǎng)可通過谷氨酸受體介導促進GnRH神經元分泌

陳 勇

目的 探討下丘腦促性腺激素釋放激素(GnRH)神經元與星形膠質細胞共培養(yǎng)對GnRH神經元的影響及其可能的相關機制。 方法 利用Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，將GnRH神經元細胞株GT1-7與原代星形膠質細胞共培養(yǎng)10 d。免疫組織化學法檢測GnRH神經元中谷氨酸受體(GluR)的分布，蛋白免疫印跡法檢測GluR在GnRH神經元中的表達，并分別通過高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測培養(yǎng)上清中的谷氨酸(Glu)和GnRH的濃度變化。 結果 共培養(yǎng)組的GnRH神經元發(fā)生mGluR5和GluR1/2/3/4從胞質到胞核的移位，在胞核中的表達較單純GT1-7培養(yǎng)組顯著增加(P<0.05)，且Western-blot檢測與免疫熒光檢測結果一致。HPLC和ELISA檢測結果表明，與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組上清中的Glu濃度顯著減少，而GnRH的分泌則明顯增加(P<0.05)。 結論 GnRH神經元與星形膠質細胞共培養(yǎng)可通過改變GluR(代謝型或離子型)在細胞內的定位與表達，從而增加GnRH的分泌。

神經元； 促性腺激素釋放激素； 神經膠質； 星形細胞； 共同培養(yǎng)技術； 受體，谷氨酸

下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)神經元是生殖內分泌調控的中樞，在性別分化、性腺發(fā)育以及生殖過程中起重要調節(jié)作用，是性生理和性行為的重要介導者。GnRH神經元的分泌受各種內外因素的影響，但其分泌調控機制迄今尚未完全明確。星形膠質細胞的功能長期以來被認為僅限于為神經元提供支持、保護和營養(yǎng)。近年來，星形膠質細胞的作用越來越受到人們重視，相關研究也取得了很大進展。星形膠質細胞通過調節(jié)GnRH神經元的活性和分泌來影響生殖生育已成為研究熱點，但其機制并未完全闡明。本研究利用GnRH神經元細胞株即GT1-7與星形膠質細胞共培養(yǎng)，旨在探討星形膠質細胞如何影響GnRH神經元的分泌活動，并對可能機制做初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞及動物：GT1-7細胞株(上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院內分泌研究所李小英教授贈送)；C57BL/6J小鼠清潔級[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2007-0005]。試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Invitrogen公司)；RIPA和PMSF(上海申能博采生物科技有限公司)；BCA Protein Assay Kit(美國Pierce公司)；ECL試劑盒和PVDF膜(英國Amersham Biosciences公司)；mGluR5(N-14)抗體、GluR1/2/3/4(H-180)抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體(美國Santa Cruz公司)；Lamin B1抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；辣根過氧化物酶標記驢抗山羊IgG抗體(江蘇碧云天生物技術公司)；GnRH檢測試劑盒(Cat no:S-1217，美國半島實驗室)。

1.2 方法

1.2.1 GT1-7的傳代培養(yǎng) GT1-7細胞常規(guī)復蘇，加入培養(yǎng)液(含4.5 g/L葡萄糖的DMEM+10%胎牛血清+100 IU/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)，于37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，長滿80%時按1∶3傳代培養(yǎng)。

1.2.2 小鼠原代星形膠質細胞培養(yǎng) 參照文獻[1]:新生1～3 d的C57BL/6J小鼠，75%酒精噴灑消毒，置無菌培養(yǎng)皿，斷頭，取全腦，解剖顯微鏡下去除小腦、腦干和嗅球，分離大腦皮層，去除腦膜及血管膜。將大腦皮層移入一干凈離心管，加入含有20 U/mL木瓜蛋白酶的鹽溶液(pH=7.2)4 mL，37 ℃水浴消化20 min，每5 min晃動1次[鹽溶液配方：NaCl 137，KCl 5.3，MgCl21，葡萄糖25，HEPES 10，CaCl23(單位：mmol/L)，以及0.5 mmol/L EDTA和0.2 mg/mL L-半胱氨酸]。吸棄鹽溶液，用含10% FBS的培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10% FBS+10 U/mL青霉素+10 U/mL鏈霉素)洗2遍終止消化反應。加入2～3 mL培養(yǎng)基吹打(約4～5次)，使組織分散。靜置，待較大組織塊沉淀后，吸取上清，收集于干凈離心管。重復前兩步，直至組織塊消失。將收集到的細胞計數(shù)，若細胞數(shù)量較多，則稀釋后計數(shù)，采用臺盼藍染色(1∶1)。根據實際情況將細胞稀釋到合適濃度(1×105～5×105mL-1)接種。72 h后換液，之后3～4 d換液1次，膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)染色鑒定細胞陽性率超過90%。

1.2.3 GT1-7與原代星形膠質細胞共培養(yǎng) 利用Transwell系統(tǒng)(美國Corning公司)，先將GT1-7常規(guī)消化，每孔1 mL細胞懸液接種至6孔板中，后每孔加上Transwell板，在Transwell板上接種1.5 mL原代星形膠細胞懸液，上下孔間的細胞并不直接接觸但可通過半透膜進行物質交流，每2 d半量換液1次，共培養(yǎng)10 d，取細胞上清液測GnRH和谷氨酸(glutamate，Glu)水平，對GT1-7細胞則抽取核蛋白(進行免疫熒光檢測的GT1-7細胞需接種至高壓滅菌過的蓋片上)，同時設單純GT1-7培養(yǎng)組為對照組。

1.2.4 培養(yǎng)液上清中GnRH濃度的檢測 共培養(yǎng)10 d時，先將培養(yǎng)液更換為含0.2% BSA的無血清高糖DMEM培養(yǎng)液孵育16 h，而后將培養(yǎng)液更換為Locke’s Mediums[NaCl 154，KCl 5.6，CaCl22.2，MgCl21，NaHCO36，葡萄糖10，HEPES 2(單位：mmol/L)，bacitracin 20 μmol/L]孵育1 h，收集上清，-80 ℃凍存，ELISA方法測定GnRH水平，按GnRH檢測試劑盒說明書操作。具體如下：先配制EIA緩沖液和標準品，而后在96孔板中每孔加入50 μL標準品或樣品，再加入25 μL抗血清，空白孔加75 μL EIA緩沖液，常溫孵育1 h，每孔加入BT-示蹤劑25 μL，常溫孵育2 h，每孔用300 μL EIA緩沖液洗滌5遍，每孔加入100 μL抗生物素化蛋白鏈菌素的HRP，常溫孵育1 h，用EIA緩沖液洗滌5遍，每孔加100 μL底物TMB，常溫放置40 min，可見形成藍色產物，每孔加入100 μL 2 mol/L的HCl終止反應，立即用全波長酶標儀測OD450 nm。對照標準曲線換算出樣品的GnRH濃度。

1.2.5 培養(yǎng)液上清中胞外Glu濃度的檢測 方法同1.2.4，培養(yǎng)液更換為含0.2% BSA的無血清DMEM培養(yǎng)液后8 h，收集培養(yǎng)液中的上清各10 μL進行Glu的檢測，胞外Glu含量使用高效液相色譜儀(1525，美國Waters公司)進行檢測。過程如下：收取10 μL待測樣品，加入50 μL OPA標記氨基酸，使用一定量0.05 mol/L的NaOH穩(wěn)定氨基酸的OPA衍生物，并將樣品稀釋20倍，然后放置于4 ℃的自動進樣器(2707，美國Waters公司)。使用Breeze軟件設置進樣體積為10 μL。使用C18色譜柱將樣品中的Glu分離，流動相A由25 mmol/L醋酸鈉、0.4% 1,4-二惡烷及4.3% 2-異丙醇組成，用醋酸調節(jié)pH至5.9；流動相B由97%甲醇、1.5% 1,4-二惡烷及1.5% 2-異丙醇組成。激發(fā)光波長338 nm，發(fā)射光由450 nm熒光檢測器(2475，美國Waters公司)。同時檢測標準品(5 μmol/L Glu)，換算出樣品的Glu濃度[1]。

1.2.6 免疫組織化學檢測GT1-7細胞中谷氨酸受體(glutamate receptor，GluR)的定位與表達 各孔吸棄培養(yǎng)基，用0.01 mol/L PBS洗3遍，4%多聚甲醛(每孔0.5 mL)固定10 min，PBS洗3次，每次10 min。封閉液(0.1% PBST+5%驢血清)室溫封閉1 h，各孔加入一抗(mGluR5 1∶50稀釋，GluR1/2/3/4 1∶50稀釋，用封閉液配制)200 μL，4 ℃孵育過夜。PBST洗滌6次，每次10 min，各孔加入相應的二抗(驢抗羊488、驢抗兔488，PBS稀釋1∶1 500)200 μL，室溫孵育1 h，PBST洗滌6次，每次10 min；DAPI復染5 min(PBS稀釋1∶4 000)，吸棄DAPI，用5 mL注射器針頭挑起蓋片，用眼科鑷夾取邊緣并倒放至多聚賴氨酸包被的載玻片上，用指甲油封邊，于暗盒中避光保存，共聚焦顯微鏡觀察實驗結果。

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western-blot)檢測GT1-7細胞核中GluR的表達變化

1.2.7.1 提取核蛋白 采用核蛋白提取試劑盒(貨號P0028，江蘇碧云天生物技術公司)，具體如下：GT1-7細胞用PBS洗1遍，用細胞刮子刮下細胞，并用移液器吹打下細胞。離心收集細胞，吸盡上清，留下細胞沉淀備用。每20 μL細胞沉淀加入200 μL添加了PMSF的細胞質蛋白抽提試劑A，最高速劇烈Vortex 5 s，把細胞沉淀完全懸浮并分散開，冰浴10～15 min；加入細胞質蛋白抽提試劑B 10 μL，最高速劇烈Vortex 5 s，冰浴1 s；最高速劇烈Vortex 5 s，4 ℃ 15 000 g離心5 min。立即吸取上清至一預冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞質蛋白。對于沉淀，完全吸盡殘余的上清，加入50 μL添加了PMSF的細胞核蛋白抽提試劑，最高速劇烈Vortex 30 s，把細胞沉淀完全懸浮并分散開，冰浴，每隔2 min再高速劇烈Vortex 30 s，共30 min。4 ℃ 15 000 r/min離心10 min，立即吸取上清至一預冷的塑料EP管中，即為抽提得到的細胞核蛋白，-80 ℃凍存。

1.2.7.2 GT1-7細胞核中GluR的表達 采用蛋白濃度檢測試劑盒(美國Pierce公司)，BCA方法測定GT1-7細胞的核蛋白濃度。根據測定的核蛋白濃度以及上樣蛋白量20 μg計算上樣的體積。采用8%分離膠，電泳分離目的蛋白(mGluR5和GluR1/2/3/4)及核蛋白內參(Lamin B1)，而后采用Bio-rad轉膜系統(tǒng)電泳轉移到PVDF膜上。PVDF膜首先用封閉液(含有0.05% Tween 20和5%脫脂奶粉的TBS緩沖液)于室溫孵育1.5 h，而后用不同一抗(GluR1/2/3/4 1∶250，mGluR5 1∶200，Lamin B1 1∶200)4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌3次后，膜用交聯(lián)有HRP的相應二抗(山羊抗兔二抗 1∶2 000，驢抗山羊二抗1∶1 000)室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，條帶用ECL發(fā)光法進行顯色，在暗盒中曝光至膠片(日本柯達公司)上，掃描后通過Quantity one軟件進行定量分析。

2 結 果

2.1 原代星形膠質細胞GFAP染色鑒定結果 經GFAP免疫熒光染色，原代星形膠質細胞胞質呈紅色(箭頭所示)，陽性率約為92%(圖1)。

A：GFAP； B：DAPI； C：Merge.圖1 原代星形膠質細胞的GFAP染色鑒定結果Fig 1 The GFAP staining of primary astrocyte tested by immunofluorescence

2.2 上清中GnRH及Glu的測定結果 ELISA檢測結果顯示，與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，GT1-7與星形膠質細胞共培養(yǎng)組GnRH的分泌顯著增加(P<0.05，圖2A)。HPLC檢測結果顯示，與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，共培養(yǎng)組上清中的GluR水平分泌顯著減少(P<0.05，圖2B)。

A：GnRH水平；B：Glu水平. Glu：谷氨酸. 與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，☆：P<0.05.圖2 上清中的GnRH及Glu水平Fig 2 The secretion level of GnRH and the glutamate concention in supernatant

2.3 免疫組織化學檢測結果 GT1-7與星形膠質細胞共培養(yǎng)組GT1-7細胞中的mGluR5和GluR1/2/3/4(即綠色熒光位置，箭頭所示)出現(xiàn)從胞質到胞核的移位(圖3)。

2.4 Western-blot檢測結果 與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，GT1-7與星形膠質細胞共培養(yǎng)組GT1-7細胞即GnRH神經元胞核中mGluR5和GluR1/2/3/4的表達均顯著增加(圖4～5)。

3 討 論

人類生殖活動受下丘腦-垂體-性腺軸的調控，GnRH是由下丘腦弓狀核的GnRH神經元合成、分泌，并貯存于正中隆起[2]，以脈沖式分泌的方式進入垂體門脈系統(tǒng)或經腦脊液進入血液。GnRH能促進垂體前葉促性腺激素細胞分泌卵泡刺激素和黃體生成素，再通過血液循環(huán)調節(jié)外周靶性腺性激素的產生和配子發(fā)生，從而調節(jié)生殖活動[3]。GnRH神經元的分泌受各種內外因素的影響，如Glu能促進GnRH的分泌，γ-氨基丁酸對GnRH分泌有抑制作用，GPR54對GnRH神經元有直接的刺激作用[4-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質細胞在調節(jié)GnRH神經元的活性和分泌過程中的作用也至關重要[8]。如星形膠質細胞分泌的轉化生長因子-β1和前列腺素E2，作用于GnRH神經元并影響其功能，也可借助黏附分子與GnRH神經元結合，通過旁分泌影響GnRH神經元功能，此外，也可通過結構重塑影響GnRH神經元的活性和分泌[9-13]。

圖3 免疫組織化學法檢測mGluR5及GluR1/2/3/4在GT1-7細胞中的定位和表達Fig 3 The location and expression of mGluR5 and GluR1/2/3/4 in GT1-7 tested by immunofluorescence

A：mGluR5的表達；B：GluR1/2/3/4的表達.圖4 Western-blot分析GT1-7細胞胞核中的mGluR5和GluR1/2/3/4的表達Fig 4 The expression of mGluR5 and GluR1/2/3/4 in the nucleus of GT1-7 detected by Western-blot

本研究結果顯示，星形膠質細胞與GnRH神經元共培養(yǎng)時，上清中的Glu顯著減少，GnRH分泌增多，且GnRH神經元胞內的mGluR5和GluR1/2/3/4被激活，出現(xiàn)從胞質向胞核的移位。Western-blot也證實，二者共培養(yǎng)時，上述GluR在GnRH神經元胞核內的表達增加。GluR分為2類：一類為離子型受體，包括N-甲基-D-天冬氨酸受體、海人藻酸受體和α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑受體(該受體家族包括4個結構極為相似的亞基GluR1/2/3/4，它們與離子通道偶聯(lián)，形成受體通道復合物，介導快信號傳遞)；另一類屬于代謝型受體(mGluR)，通過G-蛋白偶聯(lián)，調節(jié)細胞內產生第二信使，從而導致代謝改變，包括8個亞型(mGluR1～8)。這些受體被激活后產生較緩慢的生理反應。本研究顯示，二者共培養(yǎng)10 d時，GnRH神經元內2類GluR均發(fā)生定位與表達的變化，說明GluR介導的急慢性效應均參與星形膠質細胞促GnRH分泌的作用。原因可能有2個：(1)星形膠質細胞可能通過活化GnRH神經元胞內mGluR5和GluR1/2/3/4，促進Glu的利用，而適宜濃度的Glu可促進GnRH的分泌，即直接增強Glu的促分泌效應；(2)Glu是中樞神經系統(tǒng)的興奮性氨基酸，但過高濃度的Glu卻有神經毒性，可引起神經元的損傷或死亡[14]。二者共培養(yǎng)時，星形膠質細胞通過攝取一定量的Glu[15-16]，本實驗中表現(xiàn)為共培養(yǎng)時上清中的Glu水平明顯下降，解除了過高濃度的Glu對神經元造成的毒性作用，即恢復了GnRH神經元對Glu作用的敏感性，實現(xiàn)促進GnRH分泌的效應。但是該效應是由何因素(如星形膠質細胞產生的何種細胞因子)促發(fā)，且在GnRH神經元細胞內該效應通過下游何信號通路發(fā)揮作用，有待進一步深入研究。

A：mGluR5的表達；B：GluR1/2/3/4的表達. 與單純GT1-7培養(yǎng)組比較，☆：P<0.05.圖5 GT1-7細胞胞核中的mGluR5和GluR1/2/3/4的表達變化Fig 5 The histogram of expression of mGluR5 and GluR1/2/3/4 in the nucleus of GT1-7

總之，GnRH神經元與星形膠質細胞共培養(yǎng)，能改變GnRH神經元2類GluR在胞內的定位與表達，且增加GnRH的分泌。該機制可能是通過GnRH神經元GluR的移位等變化，增強興奮性神經遞質Glu對GnRH神經元的促分泌作用，或星形膠質細胞消耗多余Glu后，GnRH神經元的生理功能得到恢復。該研究結果可對星形膠質細胞調控GnRH神經元分泌的理論提供補充，并為GnRH神經元分泌調節(jié)提供一種新的調控靶點和方式，進而為生育調節(jié)提供一個新的途徑和思路。

[1] Yao P S, Kang D Z, Lin R Y,etal. Glutamate/glutamine metabolism coupling between astrocytes and glioma cells: neuroprotection and inhibition of glioma growth[J].BiochemBiophysResCommun, 2014,450(1):295-299.

[2] Terasawa E, Kurian J R, Guerriero K A,etal. Recent discoveries on the control of gonadotrophin-releasing hormone neurones in nonhuman primates[J].JNeuroendocrinol, 2010,7(22):630-638.

[3] Su S, Sun X, Zhou X,etal. Effects of gonadotrophin- releasing hormone immunization on the reproductive axis and thymulin[J].JEndocrinol, 2015,21(4):282-292.

[4] Iremonger K J, Constantin S, Liu X,etal. Glutamate regulation of GnRH neuron excitability[J].BrainResearch, 2010,1364(1):35-43.

[5] Watanabe M, Fukuda A, Nabekura J. The role of GABA in the regulation of GnRH neu-rons[J].FrontNeurosci, 2014,8(1):1-9.

[6] Pineda R, Aguilar E, Pinilla L,etal. Physiological roles of the kisspeptin/GPR54 system in the neuroendocrine control of reproduction[J].ProgBrainRes, 2010,181:55-77.

[7] Hameed S, Jayasena C N, Dhillo W S. Kisspeptin and fertility[J].JEndocrinol, 2011,208(2):97-105.

[8] Ojeda S R, Lomniczi A, Sandau U . Contribution of glial-neuronal interactions to the neuroendocrine control of female puberty[J].EurJNeurosci, 2010,32(12):2003-2010.

[9] Eroglu C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function[J].JCellCommumSignal, 2009,3(3):167-176.

[10] Clasadonte J, Poulain P, Hanchate N K,etal. Prostaglandin E2release from astrocytes triggers gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neuron firing via EP2 receptor activation[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2011,38(108):16104-16109.

[11] Sandau U S, Mungenast A E, McCarthy J,etal. The synaptic cell adhesion molecule, SynCAM1, mediates astrocyte-to-astrocyte and astrocyte-to-GnRH neuron adhesiveness in the mouse hypothalamus[J].Endocrinology, 2011,6(152):2353-2363.

[12] Sandau U S, Mungenast A E, Alderman Z,etal. SynCAM1, a synaptic adhesion molecule, is expressed in astrocytes and contributes to erbB4 receptor-mediated control of female sexual development[J].Endocrinology, 2011,152(6):2364-2376.

[13] Kumar S, Parkash J, Kataria H,etal. Enzymatic removal of polysialic acid from ne-ural cell adhesion molecule interrupts gonadotropin releasing homone(GnRH) neuron-glial remodeling[J].MolCellEndocrinol, 2012,348(1):95-103.

[14] Castillo C A, León D A, IBallesterosYáez,etal. Glutamate differently modulates meta-botropic glutamate receptors in neuronal and glial cells[J].NeurochemicalResearch, 2010,35(7):1050-1063.

[15] Hanson E, Danbolt N C, Dulla C G. Astrocyte membrane properties are altered in a rat m-odel of developmental cortical malformation but single-cell astrocytic glutamate uptake is robust[J].NeurobiolDis, 2016,89:(1)157-168.

[16] Piao C, Ralay Ranaivo H, Rusie A,etal. Thrombin decreases expression of the glutamat-e transporter GLAST and inhibits glutamate uptake in primary cortical astrocytes via the Rho kinase pathway[J].ExpNeurol, 2015,273(1):288-300.

(編輯：何佳鳳)

The Secretion of GnRH Neuron can be Enhanced by the Coculture with AstrocyteinvitroVia the Change in GluR

CHEN Yong

Department of Anatomy and Histology & Embryology, School of Basic Medical Sciences,Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China

Objective To explore the effect of coculture GnRH neuron (GT1-7) with astrocyte on the function of GnRH neuron and the mechanism associated with it. Methods GnRH neurons were cocultured with primary astrocyte for 10 days in the Transwell system. The distribution of GluR in GnRH neuron were detected by immunofluorescence. The expression of GluR in GnRH neuron were tested by Western-blot. The concentration of Glu and GnRH were measured through HPLC and ELISA respectively. Results It was observed that transfer of mGluR5 and GluR1/2/3/4 into nucleus form cytoplasm took place in the coculture group. The expression of mGluR5 and GluR1/2/3/4 in the nucleus were increased. The results of Western-blot coincided with the results of IF. The concentration of Glu in supernatant decreased but the secretion of GnRH increased in the coculture group. Conclusion The coculture of GnRH neuron with astrocyte can benefit the secretion of GnRH via the change of GluR. The distribution and expression of GluR in the GnRH neuron can be changed if GnRH neuron were cocultured with astrocyte.

neurons; gonadotropin-releasing hormone; neuroglia; astrocytes; coculture techniques; receptors, glutamate

2017-01-11

福建省自然科學基金面上項目(2014J01123)

福建醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院人體解剖學與組織胚胎學系，福州 350122

陳 勇，男，副教授，理學博士. Email: fjmucy@163.com

R322.8； R347.512； R977.1

A

1672-4194(2017)02-0097-06