吳 莉， 王林曦，2， 劉小鶯， 劉曉紅， 陳 洲， 劉禮斌

Exendin-4改善氧化應激減輕t-BHP誘導的HUVECs凋亡

吳 莉1， 王林曦1，2， 劉小鶯1， 劉曉紅1， 陳 洲3， 劉禮斌1

目的 探討Exendin-4對第三丁基過氧化氫(t-BHP)誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)凋亡的影響。 方法 在原代培養(yǎng)的HUVECs中，采用t-BHP(100 μmol/L)干預4 h，加用或不加用Exendin-4(100 nmol/L)預處理細胞24 h，分為：對照組(A組)、t-BHP處理組(B組)、Exendin-4處理組(C組)及Exendin-4+t-BHP組(D組)。應用MTT比色法檢測細胞存活率，DAPI染色熒光顯微鏡觀察細胞凋亡率，活性氧(ROS)檢測試劑盒檢測ROS的產(chǎn)生。 結(jié)果 與A組比較，100 μmol/L t-BHP作用4 h，B組的HUVECs存活率下降40%(P<0.001)；DAPI染色熒光顯微鏡觀察證實，t-BHP可以誘導HUVECs凋亡；加用Exendin-4預處理細胞24 h，D組的HUVECs存活率較B組增高(P<0.01)。DAPI染色熒光顯微鏡觀察細胞凋亡率提示，與B組比較，Exendin-4預處理可使D組的細胞凋亡率減少44%(P<0.05)，并減少ROS的產(chǎn)生(P<0.05)。 結(jié)論 t-BHP能夠誘導HUVECs凋亡，Exendin-4可減少t-BHP誘導的HUVECs凋亡。

過氧化氫； 內(nèi)皮, 血管/細胞學； 臍靜脈/細胞學； 肽類； 毒液類； 細胞凋亡； 氧化性應激

糖尿病大血管并發(fā)癥的病理基礎是動脈粥樣硬化性改變。研究表明，糖尿病患者體內(nèi)氧化應激水平增高，過強的氧化應激會誘導內(nèi)皮細胞凋亡，是動脈粥樣硬化起始和進展的重要因素[1-2]。抑制過強氧化應激所誘導的內(nèi)皮細胞凋亡可作為糖尿病血管病變防治措施的新靶點。

第三丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide, t-BHP)是過氧化氫的類似物，化學性質(zhì)穩(wěn)定，是體外研究氧化應激的常用物質(zhì)。本課題組前期研究闡明t-BHP可誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)凋亡[3]。胰升糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)是一種腸促胰島素，除有效降低血糖外，還有多種生理功能。Gaspari等研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1受體激動劑可保護內(nèi)皮功能，抑制ApoE(-/-)小鼠動脈粥樣斑塊的形成。Exendin-4是GLP-1受體激動劑[4]。本實驗擬在原代培養(yǎng)的HUVECs中觀察Exendin-4對t-BHP誘導內(nèi)皮細胞凋亡的影響，為糖尿病大血管并發(fā)癥的防護提供必要的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ECM培養(yǎng)基(批號：19602，美國ScienCell研究實驗室)；0.25%胰酶(批號：1782823，美國Gibco公司)；t-BHP(批號：#BCBN5378V，美國Sigma公司)；Exendin-4(批號：#065M4752V，美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，批號：M7423，美國MP Biomedicals)；DAPI染色液(杭州碧云天生物技術研究所)；活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測試劑盒(杭州碧云天生物技術研究所)；噻唑藍(MTT，杭州碧云天生物技術研究所)。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs原代培養(yǎng) 參照文獻[5]的原代培養(yǎng)方法收集HUVECs，用ECM培養(yǎng)基(ECM+青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL+10%胎牛血清)按2×105～3×105mL-1的細胞密度接種，在37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長約80%～90%融合時進行傳代培養(yǎng)。選用3～5代的HUVECs，以5×105mL-1的細胞密度接種于相應的培養(yǎng)板中進行相應實驗。

1.2.2 分組 參照本課題組前期研究結(jié)果[3,6]。本實驗采用100 μmol/L t-BHP干預HUVECs 4 h，Exendin-4濃度采用100 nmol/L，預處理時間為24 h。實驗分組：(1)對照組(A組)：用無血清ECM培養(yǎng)基空白預處理細胞24 h后，空白處理4 h；(2)t-BHP處理組(B組)：空白預處理細胞24 h后，t-BHP 100 μmol/L干預細胞4 h；(3)Exendin-4處理組(C組)：Exendin-4 100 nmol/L處理細胞24 h后，空白處理4 h；(4)Exendin-4+t-BHP組(D組)：Exendin-4 100 nmol/L預處理細胞24 h后，加入t-BHP 100 μmol/L作用4 h。

1.2.3 MTT檢測方法檢測細胞活力 按1.2.2實驗分組處理細胞后，各組每孔加入5 g/L MTT試劑10 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清，各孔加100 μL DMSO，振蕩10 min，用酶標儀在490 nm波長下檢測吸光度，計算細胞存活率。

1.2.4 DAPI染色用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡 按1.2.2實驗分組處理細胞后，棄上清，PBS清洗1次，加入DAPI染色液覆蓋細胞，室溫放置3～5 min，吸棄DAPI染色液，用PBS洗滌3次，封片后熒光顯微鏡(激發(fā)波長355 nm)下檢測細胞凋亡率。正常細胞表現(xiàn)為弱藍色的熒光；凋亡細胞表現(xiàn)為強藍色的熒光或表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮、邊集。

1.2.5 ROS檢測 按1.2.2實驗分組處理細胞后，棄上清，PBS清洗1次，加入DCFH-DA(用無血清ECM培養(yǎng)基稀釋使其終濃度為10 μmol/L)，37 ℃孵育20 min，用無血清ECM培養(yǎng)基洗滌細胞3次，用熒光顯微鏡在激發(fā)波長488 nm下觀察并拍照。用Image J軟件分析平均熒光強度。

2 結(jié) 果

2.1 Exendin-4對t-BHP誘導的HUVECs存活率的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，與A組比較，100 μmol/L t-BHP作用4 h，B組的HUVECs存活率下降40%(P<0.001，圖1)；加用Exendin-4預處理后，D組的HUVECs存活率(0.593±0.085)較B組(0.803±0.055)增高(P<0.01，圖1)。

Con：對照組； Ex-4：Exendin-4； t-BHP:第三丁基過氧化氫. 與對照組比較，△：P<0.001；與t-BHP組比較，#：P<0.01.圖1 Exendin-4對t-BHP誘導的HUVECs存活率的影響Fig 1 The effect of Exendin-4(100 nmol/L) on the cell viability of HUVECs induced by t-BHP

2.2 Exendin-4對t-BHP誘導HUVECs凋亡的影響 DAPI染色熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與A組比較，100 μmol/L t-BHP作用4 h，B組的HUVECs凋亡增加；Exendin-4預處理的D組的HUVECs凋亡率較B組減少44%(P<0.05，圖2)。

A：對照組；B：t-BHP干預組；C：Exendin-4處理組；D：Exendin-4+t-BHP處理組；E:凋亡率分析. 凋亡細胞為強藍色熒光或染色質(zhì)固縮、邊集. Con：對照組； Ex-4：Exendin-4； t-BHP:第三丁基過氧化氫. 與對照組比較，△：P<0.001；與t-BHP組比較，#：P<0.05.圖2 Exendin-4對t-BHP誘導的HUVECs凋亡的影響( ×200)Fig 2 The effect of Exendin-4 on the apotosis of HUVECs induced by t-BHP( ×200)

2.3 Exendin-4對活性氧產(chǎn)生的影響 與A組比較，B組的綠色熒光強度增強，平均熒光強度增高(P<0.05，圖3)；與B組比較，D組的綠色熒光強度減弱，平均熒光強度降低(P<0.05，圖3)。

3 討 論

氧化應激是老化和心血管障礙的起因，糖尿病患者體內(nèi)氧化應激水平升高，ROS產(chǎn)生增多，內(nèi)皮細胞對ROS介導的功能障礙尤為敏感。過強的氧化應激會誘導內(nèi)皮細胞凋亡，此病理過程會促進動脈粥樣硬化的起始及進展[2,7]。Cancel等也闡明內(nèi)皮細胞凋亡的病理性增加會促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展[8]。若增強抗氧化防御能力，減少氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞凋亡，可預防和延緩糖尿病患者大血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。

A：對照組；B：t-BHP干預組；C：Exendin-4處理組；D：Exendin-4+t-BHP處理組；E:平均熒光強度分析. Con：對照組；Ex-4：Exendin-4； t-BHP:第三丁基過氧化氫. 與對照組比較，△：P<0.05；與t-BHP組比較，#：P<0.05.圖3 Exendin-4對活性氧產(chǎn)生的影響( ×200)Fig 3 The effect of Exendin-4 on the generation of ROS( ×200)

t-BHP是過氧化氫的類似物，化學性質(zhì)比較穩(wěn)定，在應用于研究氧化損傷模型方面具有優(yōu)勢，已被廣泛用于建立體外氧化應激的細胞模型。本研究結(jié)果顯示，t-BHP(100 μmol/L)干預4 h，HUVECs存活率降低，DAPI染色熒光顯微鏡觀察從細胞形態(tài)學方面也證實t-BHP可誘導HUVECs凋亡。

GLP-1是一種腸促胰島素，其分泌的主要刺激物是腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的攝入。GLP-1能阻止胰島β細胞凋亡，誘導胰島β細胞再生，促進胰島素分泌，改善外周組織對胰島素的敏感性。GLP-1半衰期短，僅1～2 min，此半衰期短的特點限制了其臨床應用。近年來，大量的GLP-1類似物和GLP-1受體激動劑發(fā)展起來并逐漸走向臨床。Exendin-4是GLP-1受體激動劑，可以激活GLP-1受體，半衰期長，作為降糖新藥已成為研究關注的熱點。

隨著GLP-1受體在心血管系統(tǒng)中表達的確立，目前研究集中于GLP-1對心臟和血管系統(tǒng)的影響。針對GLP-1的臨床薈萃分析提示,GLP-1除了控制血糖、改善脂代謝、減輕體質(zhì)量等作用外，還具有獨立于上述作用之外的心血管保護作用：可以改善內(nèi)皮功能、促進心肌葡萄糖攝取、提高心臟收縮功能等[9]。研究標明，GLP-1可改善高糖環(huán)境下人臍靜脈內(nèi)皮細胞的氧化應激[10]，亦可誘導抗氧化防御基因HO-1和NQO1，減弱氧化應激誘導的基因損傷，對氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞老化有直接的保護作用[11]。從這些研究可以看出，GLP-1對氧化應激狀態(tài)下的內(nèi)皮細胞有保護作用。本研究中，ROS檢測結(jié)果提示，與B組比較，Exendin-4預處理可減少細胞ROS的產(chǎn)生。MTT檢測結(jié)果提示，加用Exendin-4預處理細胞24 h，HUVECs存活率較單獨t-BHP干預組增高。DAPI染色熒光顯微鏡檢測細胞凋亡率結(jié)果顯示，Exendin-4預處理可使HUVECs凋亡率減少。本研究中可以觀察到，Exendin-4可以減輕ROS的產(chǎn)生，減少t-BHP誘導的HUVECs凋亡。研究表明，Exendin-4激活GLP-1受體后，可通過刺激G蛋白而激活腺苷酸環(huán)化酶，形成環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)，細胞內(nèi)cAMP水平升高，進而激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)。GLP-1在發(fā)揮細胞保護作用、減少病理狀態(tài)下細胞凋亡的過程中，cAMP依賴的PKA信號通路是一關鍵途徑[12]。Ge等闡明GLP-1通過cAMP/PKA依賴的方式減少高糖誘導的心臟微血管內(nèi)皮細胞凋亡[13]。因此，筆者推測，Exendin-4可能通過cAMP/PKA通路減輕氧化應激，減少t-BHP誘導的HUVECs凋亡，此機制需要進一步研究證實。

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(編輯：張慧茹)

Exendin-4 Mitigated Oxidative Stress and Protected Human Umbilical Vein Endothelial Cells from t-BHP-induced Apoptosis

WU Li1, WANG Linxi1,2, LIU Xiaoying1, LIU Xiaohong1, CHEN Zhou3, LIU Libin1

1.Department of Endocrinology, Fujian Medical University Union Hospital;Fujian Institute of Endocrinology, Fuzhou 350001, China；2.Department of Geriatrics, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China;3.College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China

Objective To explore the effect of Exendin-4 on human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)apoptosis induced by tert-butyl hydroperoxide(t-BHP). Methods Primary HUVECs were induced by t-BHP(100 μmol/L) for 4 h, with or without pretreatment of Exendin-4(100 nmol/L)for 24 h. The cells were divided into four groups: control group(A group), t-BHP group(B group), Exendin-4 group(C group) and Exendin-4+t-BHP(D group). MTT assay was used to measure the cell viability, and fluorescence microscopic analysis with DAPI staining was used to evaluate the apoptotic rate of HUVECs. Reactive oxygen species(ROS) detection kit was used to detect the generation of ROS. Results Following t-BHP administration, the HUVECs viability of B group decreased about 40%(P<0.001)compared to A group and fluorescence microscopy confirmed that t-BHP was inducing HUVECs apoptosis. The viability of HUVECs of D group was increased than that of B group(P<0.01). The fluorescence microscopic analysis with DAPI staining showed that the apoptosis rate of HUVECs of D group decreased about 44% (P<0.05)than that of B group. The Generation of ROS was attenuated by Exendin-4 pretreatment compared to B group(P<0.05). Conclusion t-BHP could induce apoptosis of primary HUVECs, and Exendin-4 could protect HUVECs from t-BHP-induced apoptosis.

hydrogen peroxide； endothelium, vascular/cytology; umbilical veins/cytology; peptides; venoms; apoptosis; oxidative stress

2016-10-11

福建省科技重點項目(2013Y0041)；福建省衛(wèi)生和計劃生育委員會青年項目(2014-1-43)；福建醫(yī)科大學苗圃基金(2014MP031)

福建醫(yī)科大學 1.附屬協(xié)和醫(yī)院 內(nèi)分泌科，福建省內(nèi)分泌研究所, 福州 350001;2.附屬協(xié)和醫(yī)院 老年病科，福州 350001；3.藥學院，福州 350122

吳 莉，女，住院醫(yī)師，醫(yī)學碩士

劉禮斌. Email:libin.liu@fjmu.edu.cn

R322.123； R329.24； R329.25； R977.6； R996.3

A

1672-4194(2017)02-0088-04