丁淑琴，解秀梅，張 凱，洪 虓，王 錦，胡建國(guó)

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,蚌埠 233004；*通訊作者,E-mail:59270847@qq.com)

口腔腫瘤組織中HPV感染和P16蛋白表達(dá)的臨床意義

丁淑琴*，解秀梅，張 凱，洪 虓，王 錦，胡建國(guó)

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,蚌埠 233004；*通訊作者,E-mail:59270847@qq.com)

目的 檢測(cè)口腔腫瘤中HPV感染及P16蛋白表達(dá)率,并分析其臨床意義。 方法 收集44例口腔腫瘤的新鮮組織標(biāo)本,采用PCR法進(jìn)行HPV DNA檢測(cè),免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中P16的表達(dá)情況。分析HPV感染與P16的相關(guān)性。 結(jié)果 44例口腔腫瘤組織中HPV感染率為47.7%(21/44),P16陽性表達(dá)率為77.3%(34/44),44例標(biāo)本中HPV感染與P16表達(dá)無關(guān)聯(lián)(P>0.05)。與P16陰性組相比,P16陽性組男性、非吸煙、非飲酒者所占比例稍高,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 結(jié)論 口腔腫瘤患者與HPV感染密切有關(guān),口腔腫瘤患者P16表達(dá)和HPV感染無關(guān)聯(lián)性,P16本身可能就可作為誘發(fā)口腔腫瘤發(fā)生的獨(dú)立因素。

人乳頭瘤病毒; 口腔腫瘤; P16

人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是某些皮膚和黏膜良惡性腫瘤的發(fā)病原因,尤其是宮頸癌發(fā)生的最重要原因。最近研究發(fā)現(xiàn),HPV感染與頭頸部腫瘤發(fā)病也有關(guān),HPV感染相關(guān)的頭頸部腫瘤患者數(shù)量不斷增加[1,2]。HPV成為繼煙草、酒精之后引發(fā)頭頸部腫瘤發(fā)生的又一大因素[1,2],尤其是在口腔腫瘤、無抽煙及喝酒嗜好的病人中起重要作用[3-6],HPV有關(guān)的口腔腫瘤發(fā)生率呈快速增加趨勢(shì)[7]。目前國(guó)外研究證實(shí),HPV陽性的口腔腫瘤是一個(gè)獨(dú)立的亞型,有獨(dú)特的分子生物學(xué)及臨床病理特點(diǎn)[8],影響口腔腫瘤患者的預(yù)后。但如今國(guó)內(nèi)尚缺乏較大宗的臨床資料來指導(dǎo)HPV相關(guān)口腔腫瘤的診斷和治療,對(duì)口腔腫瘤與HPV感染相關(guān)性的病因?qū)W探討也不多,其具體致病機(jī)制尚不清楚。另外,有研究報(bào)道,口腔腫瘤中P16抑癌基因的產(chǎn)物P16蛋白的表達(dá)與HPV感染密切相關(guān),并有研究者建議可作為HPV的替代檢測(cè)手段[9,10]。皖北地區(qū)是口腔腫瘤的多發(fā)地區(qū)之一,本地區(qū)口腔腫瘤中HPV的感染率如何?P16蛋白在口腔腫瘤組織的表達(dá)如何?HPV感染和P16蛋白相關(guān)性如何?這些都是我們需要回答的問題。

本研究中HPV-DNA檢測(cè)采用SPF10[11,12]PCR-凝膠成像法,SPF10(short PCR fragment)PCR方法已經(jīng)在宮頸鱗癌的研究中被建立及使用,但目前還很少用于口腔腫瘤的研究。SPF10的引物集擴(kuò)增的是HPV DNA高度保守區(qū)L1區(qū)的一部分,產(chǎn)物長(zhǎng)度為65 bp。本研究通過檢測(cè)皖北地區(qū)口腔腫瘤中HPV感染及P16蛋白的表達(dá),結(jié)合臨床病例特點(diǎn)進(jìn)行分析,以期為口腔腫瘤的初步診斷提供有用的指標(biāo)及為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2014-10～2015-10蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科初治口腔腫瘤患者的組織44例,年齡26-79歲,平均年齡57歲,均經(jīng)病理檢查診斷,術(shù)前均未化療或放療。同時(shí)收集了該醫(yī)院口咽部非腫瘤患者組織20例(包括口腔部外傷或鼾癥矯形手術(shù)、炎癥、囊腫)用作對(duì)照組。

1.2 取材方法

1.3 主要試劑

DNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司,HPV通用引物SPF10由上海生工合成,SPF10引物集的序列見表1,SPF10[6]的引物集擴(kuò)增的是HPV DNA高度保守區(qū)L1區(qū)的一部分,產(chǎn)物長(zhǎng)度為65 bp,為39種HPV型別核酸序列中6582-6646這段序列。這39種型別為HPV16，6，11，13，18，26，30，31，33-35，39，40，42-45，51-56，58，59，61，62，64，66-70，72-74，MM4，MM7，MM8,囊括了所有黏膜高危型(7種),目前被認(rèn)為黏膜低危型別中除32型外也都囊括在內(nèi),詳細(xì)內(nèi)容參見文獻(xiàn)[8，9]。PCR試劑盒為Thermo fish公司產(chǎn)品,兔抗人P16單克隆抗體購自abcam公司,SP免疫組織化學(xué)試劑盒購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

表 1 SPF10的引物集序列

Table 1 Sequences of SPF10 primers

SPFprimers序列(5′→3′) SPF1AGCiCAGGGiCACAATAATGGSPF1BGCiCAGGGiCATAACAATGGSPF1CGCiCAGGGiCATAATAATGGSPF1DGCiCAAGGiCATAATAATGGSPF2BGTiGTATCiACAACAGTAACAAASPF2DGTiGTATCiACTACAGTAACAAA

i:次黃嘌呤;SPF1:上游引物;SPF2:下游引物

1.4 SPF10 PCR法檢測(cè)HPV-DNA

①將冷凍的組織標(biāo)本勻漿，然后按試劑盒操作說明書進(jìn)行人基因組DNA的提取。②使用HPV通用引物SPF10進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為65 bp。每次PCR反應(yīng)都設(shè)有陰性質(zhì)控(distilled H2O)和陽性質(zhì)控(已知HPVHPV陽性標(biāo)本)。③使用GAPDH作內(nèi)參,GAPDH引物序列上游:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,下游:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC′-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為258 bp。④用3%瓊脂糖電泳并成像。⑤結(jié)果判斷:在65 bp處有明顯條帶者為HPV陽性。

1.5 免疫組化檢測(cè)P16蛋白的表達(dá)

使用常規(guī)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)口腔腫瘤和口腔部非腫瘤組織中的P16蛋白的表達(dá),P16一抗稀釋度(1 ∶100)，抗原修復(fù)采用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高壓蒸汽修復(fù)法。用羊血清替代一抗作為陰性對(duì)照,用已知陽性切片作為陽性對(duì)照。

免疫組化結(jié)果判定：P16陽性染色為細(xì)胞核和胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。判定標(biāo)準(zhǔn):采用半定量方法,采用高倍視野隨機(jī)記數(shù)500個(gè)腫瘤細(xì)胞,按陽性細(xì)胞所占比例,分為4級(jí),≤5%為陰性(-),>5%-25%為輕度陽性(+),>25%-75%為中度陽性(++),>75%以上為強(qiáng)陽性(+++)。由兩位病理科醫(yī)生雙盲閱片并判定結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 口腔腫瘤與非腫瘤組織中HPV感染情況及其相關(guān)性

采用PCR法檢測(cè)口腔腫瘤組織中HPV DNA(見圖1)。選取陽性標(biāo)本進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定(見圖2)，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行B1ast比對(duì)，結(jié)果顯示所獲得的HPV DNA序列與GenBank中人HPV DNA相同(見圖3)。本研究觀察到44例口腔腫瘤患者中21例HPV陽性,陽性率47.7%;20例非腫瘤患者中2例HPV陽性,陽性率僅10.0%(見表2),口腔腫瘤患者可能與HPV感染密切有關(guān)(χ2=8.501,P=0.004)。

1-3.HPV陽性標(biāo)本;4.HPV陰性標(biāo)本;5.HPV陽性質(zhì)控;6.陰性質(zhì)控;M.DNA Marker圖1 HPV DNA擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳成像 Figure 1 Agarose electrophoresis of HPV DNA PCR production

圖2 HPV PCR產(chǎn)物測(cè)序的圖譜Figure 2 Sequencing of HPV PCR production

圖3 HPV PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果的序列比對(duì)Figure 3 Sequence blast of HPV PCR production

表 2 口腔腫瘤與非腫瘤組織中HPV感染情況和P16蛋白表達(dá)情況

Table 2 HPV infection and P16 protein expression in oral neoplasms and non-neoplastic tissue

組織nHPVP16+-χ2P+-χ2P口腔部腫瘤 口腔部非腫瘤44203122318850100043401020329700000

2.2 不同HPV狀態(tài)的口腔部腫瘤P16蛋白表達(dá)情況及其關(guān)聯(lián)性

免疫組化檢測(cè)P16蛋白在口腔腫瘤組織中表達(dá)，在細(xì)胞核或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)(見圖4)。44例口腔腫瘤患者中34例P16陽性,陽性率77.3%,而20例非腫瘤患者P16均陰性。通過分析44例口腔標(biāo)本,發(fā)現(xiàn)HPV與P16僅存在弱關(guān)聯(lián)。21例HPV陽性患者中P16陽性18例(85.71%),但HPV陰性患者中P16陽性率也較高,為69.56%(16/23)(見表3)。提示除HPV外,某些其他因素也可使P16蛋白表達(dá)上調(diào)或P16本身就可作為誘發(fā)口腔腫瘤發(fā)生的獨(dú)立因素。

A-C為口腔正常組織,D-F為口腔腫瘤組織;A,D.口腔腫瘤組織HE染色(×400);B,C,E,F.P16免疫組化結(jié)果(B，E.×100;C，F(xiàn).×400)圖4 P16在口腔腫瘤組織中的表達(dá)Figure 4 P16 protein expression in oral tumor

表 3 HPV陽性和陰性的口腔部腫瘤P16蛋白表達(dá)情況(以5%為界)

Table 3 P16 protein expression in HPV-positive and HPV-negative oral tumor

P16HPV?DNA(+)HPV?DNA(-)合計(jì)(+)181634(-)3710合計(jì)212344

2.3 口腔腫瘤患者HPV感染及P16蛋白表達(dá)與臨床特征比較

HPV及P16的陽性組與陰性組相對(duì)比,年齡、性別、吸煙、飲酒、發(fā)病部位均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但HPV及P16的陽性組中男性、非吸煙、非飲酒者比例相對(duì)更高,但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表4)。

3 討論

HPV是一種DNA病毒,屬乳多空病毒科乳頭狀瘤病毒屬。廣泛存在于自然界中,是一組致瘤性病毒。因越來越多腫瘤被發(fā)現(xiàn)與HPV感染有關(guān),使得HPV日益被人們重視及研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,對(duì)HPV的致病機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。游離或整合狀態(tài)的HPV-DNA潛入宿主細(xì)胞,引起一系列的變化,使細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化發(fā)生異常[13]。雖然HPV已被普遍公認(rèn)為是一種腫瘤相關(guān)病毒,但過去較多的研究都集中在HPV與宮頸癌的關(guān)系上。近來,HPV與頭頸部腫瘤的關(guān)系受到廣泛的關(guān)注,并有一系列的報(bào)道闡述了HPV在不同部位的頭頸部腫瘤中的表達(dá),檢出率為20%-100%不等[14]。本次研究表明HPV感染在口腔腫瘤中的感染率為47.7%,由于本次研究重點(diǎn)是探究HPV總感染率,未進(jìn)行分型,僅隨機(jī)抽取了3個(gè)HPV陽性標(biāo)本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并比對(duì),結(jié)果均為HPV16型,與報(bào)道的HPV16型是HPV陽性口腔腫瘤的最常見型別相符[15,16]。國(guó)外的大量臨床試驗(yàn)結(jié)果均表明:與HPV陰性相比,HPV陽性口腔腫瘤患者腫瘤進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)較低,對(duì)放化療治療更加敏感,且預(yù)后明顯好于HPV陰性口腔腫瘤患者[17,18]。因此,對(duì)于HPV陽性口腔腫瘤患者可考慮降低局部治療的強(qiáng)度,包括降低放療劑量、單純放療代替放化療或用靶向治療替代化療。希望在不久的將來,我們能夠根據(jù)HPV感染狀態(tài)來判斷口腔腫瘤患者的預(yù)后并指導(dǎo)治療決策,為HPV陽性口腔腫瘤患者制定個(gè)體化的治療方案以改善預(yù)后,降低治療相關(guān)毒性,提高患者的生活質(zhì)量。

表 4 口腔腫瘤患者HPV感染及P16蛋白表達(dá)與臨床特征比較

Table 4 Correlation of HPV infection, P16 protein expression and other parameters in oral neoplasms

臨床特征HPV感染+-卡方值PP16表達(dá)+-P年齡082003650817a ≤60歲1210175 >60歲913175性別086303530654a 男1413234 女710116吸煙019506590172a 是6886 否1515264飲酒003008620754a 是5683 否1617267部位0．13205610442a 牙齦610124 舌6693 頰3461 頜6372

a期望計(jì)數(shù)小于5,用Monte Carlo法計(jì)算

P16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因,是一種多腫瘤的抑制基因。到目前為止,已經(jīng)在人類的許多惡性腫瘤及頭頸部腫瘤中檢測(cè)到P16基因的改變[19],引起許多學(xué)者在多領(lǐng)域的廣泛研究。有研究表明P16基因在口腔頜面部多種惡性腫瘤中表現(xiàn)異常[20]。最近有學(xué)者報(bào)道,在口腔腫瘤患者中P16蛋白的表達(dá)與HPV感染密切相關(guān),并認(rèn)為可以將較廉價(jià)且操作相對(duì)簡(jiǎn)單的P16免疫組化作為HPV感染檢測(cè)的替代檢測(cè)手段[9,10];而有些學(xué)者則報(bào)道在口腔腫瘤中沒有發(fā)現(xiàn)P16表達(dá)與HPV感染的相關(guān)性,不主張將P16表達(dá)狀態(tài)作為HPV感染強(qiáng)有力的替代檢測(cè)指標(biāo)[21-23]。本研究中雖然21例HPV陽性口腔腫瘤中有18例P16蛋白陽性,但P16蛋白在23例HPV陰性口腔腫瘤中也有16例陽性,P16在HPV陽性與HPV陰性口腔腫瘤中的表達(dá)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P>0.05)。本研究結(jié)果與Harris等[24]的研究結(jié)果一致,Harris等研究表明,其所觀察的年輕舌癌患者中,在HPV低感染的前提下,仍有P16的高表達(dá),提示P16可以作為誘發(fā)年輕舌癌患者的獨(dú)立因素[24]。本研究中,P16蛋白陽性的口腔腫瘤中只有52.94% HPV陽性(18/34),故推測(cè)P16本身就可作為誘發(fā)口腔腫瘤發(fā)生的獨(dú)立因素。國(guó)外一些研究顯示,P16蛋白高表達(dá)的口腔腫瘤患者有更好的治療效果和預(yù)后[26]。希望隨著研究的深入,P16基因能為口腔腫瘤乃至其他腫瘤的預(yù)防、診斷和治療提供新的思路。

本課題組分析了HPV和P16與口腔腫瘤患者煙酒嗜好乃至性別等的關(guān)系,結(jié)果表明,與HPV陰性組相比,HPV陽性組男性、非抽煙、非嗜酒者所占比例較高,但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與P16蛋白陰性組相比,P16陽性組男性、非抽煙、非嗜酒者所占比例也較高,差異也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述,本研究表明:HPV是口腔腫瘤發(fā)生的重要致瘤因素;P16也可能是誘發(fā)口腔腫瘤發(fā)生的獨(dú)立因素。但因本研究樣本例數(shù)有限,結(jié)果尚帶有偶然性,仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

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Clinical value of HPV infection and P16 protein expression in oral neoplasms

DING Shuqin*,XIE Xiumei,ZHANG Kai,HONG Xiao,WANG Jin,HU Jianguo

(DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China;*Correspondingauthor,E-mail:59270847@qq.com)

ObjectiveTo investigate the infection rate of human papillomavirus(HPV) and P16 protein expression in oral neoplasm tissues and their clinical value.MethodsHPV DNA was detected by PCR and P16 protein was determined in 44 cases of oral tumor tissue by immunohistochemistry. The correlation of HPV infection with P16 protein expression was assessed.ResultsThe incidence of HPV infection in oral tumor was 47.7%(21/44).The P16 was expressed in 77.3%(34/44) of the tumor tissues.The P16 protein expression was not correlated with the presence of HPV infection in 44 specimens(P>0.05). The proportions of male non-smokers and non-drinkers were higher in P16-positive group than in P16-negative group, respectively, but the difference was not statistically significance(P>0.05).ConclusionOral cancer is highly correlated with the infection of HPV, and P16 could be an independent risk factor for oral cancer.

oral neoplasms; HPV; P16 protein

安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)研究一般項(xiàng)目(KJ2015B081by,KJ2015B052by);蚌埠醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新課題項(xiàng)目(Byycxz1508)

丁淑琴,女,1980-11生,碩士,主管技師,講師,E-mail:59270847@qq.com

2017-02-28

R739.85

A

1007-6611(2017)07-0724-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.019