王 豐，王 慧,吳麗賢,鄭 鳴*

(1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州 350004;2福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理系;*通訊作者,E-mail:zming_1956@163.com)

鈣調(diào)蛋白小亞基Capn4對依托鉑甙誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞CNE2 DNA損傷修復(fù)的作用

王 豐1，王 慧2,吳麗賢2,鄭 鳴2*

(1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福州 350004;2福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理系;*通訊作者,E-mail:zming_1956@163.com)

目的 研究鈣調(diào)蛋白小亞基Capn4對依托鉑甙(VP-16)誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞CNE2 DNA損傷修復(fù)中的作用及可能影響的修復(fù)通路。 方法 構(gòu)建shRNA下調(diào)Capn4表達(dá)的CNE2細(xì)胞并以Western blot法驗(yàn)證;高內(nèi)涵檢測γ-H2AX在CNE2細(xì)胞及下調(diào)Capn4表達(dá)的CNE2細(xì)胞中的平均熒光強(qiáng)度,分析下調(diào)Capn4對 VP-16誘導(dǎo)的CNE2細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的作用;NHEJ(非同源重組修復(fù))通路特異性的質(zhì)粒EJ5-GFP用Fugen6 HD轉(zhuǎn)入CNE2細(xì)胞及下調(diào)Capn4的CNE2細(xì)胞,用高內(nèi)涵儀檢測GFP的陽性率,觀察下調(diào)Canp4對VP-16誘導(dǎo)的鼻咽癌細(xì)胞DNA損傷NHEJ修復(fù)通路的影響。 結(jié)果 shRNA確實(shí)下調(diào)Capn4在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)。2.5 μmol/L VP-16處理CNE2Vector細(xì)胞和CNE2Capn4(-)細(xì)胞后6 h和12 h,CNE2Capn4(-)的損傷都較空載體的CNE2Vector細(xì)胞高;下調(diào)Capn4表達(dá)對VP-16造成的CNE2細(xì)胞DNA損傷修復(fù)有抑制作用(P<0.01)。2.5 μmol/L VP-16作用后,CNE2Capn4(-)細(xì)胞與CNE2Vector細(xì)胞相比較GFP平均熒光強(qiáng)度明顯更低;下調(diào)CNE2表達(dá)能夠抑制DNA損傷后NHEJ通路的修復(fù)(P<0.01)。 結(jié)論 在鼻咽癌細(xì)胞中下調(diào)Capn4的表達(dá)能抑制VP-16所致的DNA損傷修復(fù),這種作用可能是通過抑制NHEJ通路實(shí)現(xiàn)的。

Capn4; 鼻咽癌; VP-16; shRNA; NHEJ通路

鼻咽癌是起源鼻咽上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,發(fā)病率具有明顯的地域分布特征,在東南亞地區(qū)和中國南方有極高的發(fā)病率[1]。鼻咽癌的主要治療手段是放療,總體療效較好,但仍有較多患者存在放療照射野內(nèi)局部的殘留和復(fù)發(fā),提示在這部分患者中存在放療抵抗,這與DNA雙鍵斷裂[2]損傷修復(fù)機(jī)制(DNA damage repair,DDR)有密切的關(guān)系。不能修復(fù)的DSB將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。DNA修復(fù)主要通過兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn):一種是同源重組修復(fù)(HR),使用姐妹染色體的同源序列重新合成DNA;另一種是非同源重組修復(fù)(NHEJ),斷裂的DNA末端重新連接,可以在沒有模板的情況下進(jìn)行DNA修復(fù),但也更容易發(fā)生錯誤。DNA修復(fù)能力異常激活和增強(qiáng)是導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎(chǔ);相反,修復(fù)缺陷則使腫瘤對放化療提高敏感性。依托泊苷(VP-16)是鬼臼毒素的半合成衍生物,誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)生DNA雙鏈損傷,有文獻(xiàn)報(bào)道VP-16誘導(dǎo)DNA損傷的同時(shí),促進(jìn)NHEJ修復(fù),這可能是鼻咽癌化療抵抗的的原因之一[3]。鈣調(diào)蛋白Calpain[4]是Ca2+依賴半胱氨酸蛋白水解酶,Capn4是Calpain小分子亞基,分子量為28 kDa,使Calpain形成二聚體。目前在多種腫瘤中有發(fā)現(xiàn)Calpain的異常表達(dá)。Calpain參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[5，6]。本研究擬研究鈣調(diào)蛋白小亞基Capn4對VP-16所致的鼻咽癌細(xì)胞CNE2 DNA損傷修復(fù)的作用及可能影響的修復(fù)通路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

人鼻咽癌細(xì)胞CNE2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,293T細(xì)胞購自福建醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞動物實(shí)驗(yàn)中心。Capn4下調(diào)的人鼻咽癌細(xì)胞CNE2Capn4(-)和空載體轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞CNE2Vector為藥學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。Hyclone RPMI1640 培養(yǎng)基和Hyclone胎牛血清均購于美國ThermoScientific。慢病毒質(zhì)粒pGC-LV、包裝質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0 購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。高內(nèi)涵檢測γ-H2AX試劑盒購自美國Thermo scientific公司。VP-16注射液購自齊魯制藥有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CNE2細(xì)胞、293T細(xì)胞、CNE2Vector和CNE2Capn4(-)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素100 IU/ml和鏈霉素100 μg/ml的RPMI 1640 培養(yǎng)液中,置37℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 構(gòu)建shRNA載體轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞抑制Capn4表達(dá)

Genbank中Capn4基因已知序列見圖1。

1 gggggcggtg cttgatatgg gagtagtctg attgtgtggg accaggacaa tgtggtcctg

61 aggggactga tgtggagttt tggcgggtgg ggcttatggg tctgggctca gcctgcattg

121 gctaacctgg agatgaacgt taaagcgagg cggctgcgca gtacaacccg gagcccccgc

181 ccccacgcac acattactcc aacattgagg ccaacgagag tgaggaggtc cggcagttcc

241 ggagactctt tgcccagctg gctggagatg acatggaggt cagcgccaca gaactcatga

301 acattctcaa taaggttgtg acacgacacc ctgatctgaa gactgatggt tttggcattg

361 acacatgtcg cagcatggtg gccgtgatgg atagcgacac cacaggcaag ctgggctttg

421 aggaattcaa gtacttgtgg aacaacatca aaaggtggca ggccatatac aaacagttcg

481 acactgaccg atcagggacc atttgcagta gtgaactccc aggtgccttt gaggcagcag

541 ggttccacct gaatgagcat ctctataaca tgatcatccg acgctactca gatgaaagtg

601 ggaacatgga ttttgacaac ttcatcagct gcttggtcag gctggacgcc atgttccgtg

661 ccttcaaatc tcttgacaaa gatggcactg gacaaatcca ggtgaacatc caggagtggc

721 tgcagctgac tatgtattcc tgaactggag ccccagaccc gccccctcac tgccttgcta

781 taggagtcac ctggagcctc ggtctctccc agggccgatc ctgtctgcag tcacatcttt

841 gtggggcctg ctgacccaca agcttttgtt ctctcagtac ttgttaccca gcttctcaac

901 atccagggcc caatttgccc tgcctggagt tccccctggc tctaggacac tctaacaagc

961 tctgtccacg ggtctcccca ttcccaccag gccctgcaca cacccactcc gtaacctctc

1021 ccctgtacct gtgccaagcc tagcacttgt gatgcctcca tgccccgagg gccctctctc

1081 agttctggga ggatgactcc agtccctgca cgccctggca cacccttcac ggttgctacc

1141 caggcggcca agctccagac cgtgccagac ccaggtgccc cagtgccttt gtctatattc

1201 tgctcccagc ctgccaggcc caggaggaaa taaacatgcc ccagttgctg atctctaaaa

1261 aaaaaaaaaa a

圖1 Genbank中Capn4基因已知序列
Figure 1 The known sequencing of Capn4 gene in Genbank

根據(jù)Genbank中Capn4基因已知序列,按siRNA序列設(shè)計(jì)原則,應(yīng)用Ambion公司網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì),并將選出的siRNA序列進(jìn)行BLAST搜索,作同源性分析以保證序列的特異性,最后確定3個(gè)區(qū)段。根據(jù)capn4cDNA序列構(gòu)建表達(dá)capn4 mRNA特異的,含綠色熒光蛋白基因(EGFP)的shRNA 真核表達(dá)質(zhì)粒CAPNS1-RNAi。CAPNS1-RNAi作用的3個(gè)靶序列分別為5′-CCACAGAACTCATGAACAT-3′ (CAPNS1-RNAi89)、5′-AGGCCATATACAAACAGTT-3′(CAPNS1-RNAi90)及5′-ATGTTCCGTGCCTTCAAAT-3′(CAPNS1-RNAi91);陰性對照CON207作用的靶序列為:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。利用包裝質(zhì)粒pHelper 1.0和pHelper 2.0轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞,并用Western blot法測Capn4的表達(dá)情況。

1.4 高內(nèi)涵技術(shù)檢測細(xì)胞DNA損傷

取對數(shù)生長期CNE2Vector和CNE2Capn4(-)細(xì)胞以適合的密度接種在96孔板中,次日細(xì)胞貼壁后,分組進(jìn)行藥物處理,用不同濃度VP-16處理CNE2細(xì)胞2 h,高內(nèi)涵技術(shù)檢測其DNA損傷情況,用2.5 μmol/L濃度作為造模損傷濃度,預(yù)處理CNE2細(xì)胞2 h,洗掉藥物,加入新培養(yǎng)基重新孵育,在0,6,12,24 h,檢測其DNA損傷情況;PBS洗滌2次,棄上清;每管加入100 μl固定液,室溫 15 min,離心棄上清,用100 μl Wash Buffer洗滌2 次,每次10 min,棄上清;每孔加入100 μl Permeabilization Buffer,室溫 15 min,離心棄上清,用100 μl Wash Buffer洗滌2次,每次10 min,棄上清;封閉。每孔加入100 μl 1× Blocking Buffer,室溫 15 min,離心棄上清;每孔加入50 μl一抗,室溫1 h,離心棄上清,用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗滌2次,每次10 min,棄上清;用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗滌2次,每次10 min,棄上清;每孔加入50 μl二抗,室溫避光45 min,離心棄上清,用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗滌2 次,每次10 min,棄上清;用100 μl Wash Buffer Ⅱ洗滌2次,每次10 min,棄上清;每孔再加入新的200 μl Wash Buffer,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板中,平板離心機(jī)離心,上機(jī)檢測。

1.5 DNA損傷后NHEJ修復(fù)通路檢測

將NHEJ通路特異性的質(zhì)粒EJ5-GFP用Fugen6 HD轉(zhuǎn)入CNE2Vector和CNE2Capn4(-)細(xì)胞,選擇穩(wěn)定表達(dá)EJ5-GFP的CNE2/EJ5-GFP細(xì)胞,轉(zhuǎn)入pCBASceI質(zhì)粒表達(dá)I-SceⅠ酶,切割EJ5-GFP基因,形成雙鏈斷裂(DSB),如果細(xì)胞通過NHEJ途徑修復(fù)將表達(dá)GFP,用高內(nèi)涵儀檢測GFP的陽性率,可檢測出通過NHEJ修復(fù)的細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建3株shRNA載體轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞下調(diào)Capn4表達(dá)并以Western blot驗(yàn)證

三株shRNA載體(CAPNS1-RNAi21291-1, CAPNS1-RNAi21290-1, CAPNS1-RNAi21289-2)構(gòu)建成功并轉(zhuǎn)染CNE2,均下調(diào)Capn4在CNE2中的表達(dá),其中CAPNS1-RNAi21289-2下調(diào)Capn4表達(dá)最顯著,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖1)。

1.CNE2； 2.CNE2Vector； 3.RNAi-21290-1；4.RNAi-21289-2； 5.RNAi-21291-1圖1 Western blot分析3株shRNA下調(diào)Capn4在CNE2中的表達(dá)Figure 1 Expression of Capn4 after transfected with three shRNA in CNE2 cells by Western blot

2.2 ArrayScanTM高內(nèi)涵技術(shù)檢測VP-16對CNE2Vector和CNE2Capn4(-)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響

用不同濃度VP-16處理CNE2細(xì)胞2 h,高內(nèi)涵技術(shù)檢測其DNA損傷情況,由圖2可以看到,隨著VP-16濃度的增加,其DNA損傷率呈濃度依賴性上升。用2.5 μmol/L濃度作為造模損傷濃度,預(yù)處理CNE2細(xì)胞2 h,洗掉藥物,加入新培養(yǎng)基重新孵育,在0,6,12,24 h,檢測其DNA損傷情況,由圖3可知,隨著時(shí)間的推延,DNA損傷逐漸被修復(fù)。

用2.5 μmol/L濃度VP-16處理CNE2Vector細(xì)胞和CNE2Capn4(-)細(xì)胞2 h,洗掉藥物,加入新培養(yǎng)基重新孵育,在0,6,12 h,高內(nèi)涵檢測各組細(xì)胞γ-H2AX的平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示,在6 h和12 h,CNE2Capn4(-)的損傷都較空載體的CNE2Vector細(xì)胞高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05見圖4)。

圖2 ArrayScanTM高內(nèi)涵檢測VP-16對CNE2細(xì)胞DNA損傷的量效Figure 2 Effect of ArrayScan High-Content Systems on DNA damage and repair of CNE2Vectorand CNE2Capn4(-) cells treated with different doses of VP-16

2.3 NHEJ通路特異性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE2細(xì)胞后分析Capn4 對DNA損傷修復(fù)的作用

將NHEJ通路特異性的質(zhì)粒EJ5-GFP用Fugen6 HD轉(zhuǎn)入細(xì)胞,選擇穩(wěn)定表達(dá)EJ5-GFP的細(xì)胞株,轉(zhuǎn)入pCBASceI質(zhì)粒表達(dá)I-SceⅠ。2.5 μmol/L的VP-16作用后,選取48 h時(shí)間點(diǎn),用ArrayScanTM高內(nèi)涵分析修復(fù)后的GFP平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示:在獲得I-SceⅠ限制性酶切位的表達(dá)EJ5-GFP的CNE2Capn4(-)細(xì)胞與CNE2Vector細(xì)胞細(xì)胞,以2.5 μmol/L的VP-16作用48 h,CNE2Capn4(-)細(xì)胞的GFP平均熒光強(qiáng)度明顯更低(P<0.01,見圖5)。

圖4 ArrayScanTM高內(nèi)涵檢測VP-16對CNE2Vector細(xì)胞和CNE2Capn4(-)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響Figure 4 Effect of ArrayScan High-Content Systems on DNA damage and repair of CNE2Vectorand CNE2Capn4(-) cells

A.未加藥處理共同轉(zhuǎn)染EJ5-GFP和I-SceⅠ限制性酶切質(zhì)粒的CNE2Vector細(xì)胞;B.VP-16作用48 h,共同轉(zhuǎn)染EJ5-GFP和I-SceⅠ限制性酶切質(zhì)粒的CNE2 Vector細(xì)胞;C.未加藥共同轉(zhuǎn)染EJ5-GFP和I-SceⅠ限制性酶切質(zhì)粒的CNE2Capn4(-)細(xì)胞;D.VP-16作用48 h,共同轉(zhuǎn)染EJ5-GFP和I-SceⅠ限制性酶切質(zhì)粒的CNE2Capn4(-)細(xì)胞圖5 ArrayScanTM高內(nèi)涵檢測VP-16對CNE2細(xì)胞NHEJ修復(fù)通路的影響 (×10)Figure 5 Effect of high content technique on NHEJ repair pathway in CNE2Vector and CNE2Capn4(-)cells (×10)

3 討論

鼻咽癌治療常使用的放療和化療方案往往通過損傷DNA來殺滅鼻咽癌細(xì)胞。DNA雙鍵斷裂(DNA double strain break,DSB)是最嚴(yán)重的DNA損傷方式[2]。在DNA損傷中,DSB對腫瘤細(xì)胞是最致命的打擊,它的修復(fù)主要通過兩種機(jī)制實(shí)現(xiàn):一種是HR,使用姐妹染色體的同源序列重新合成DNA,需要Rad51[7],BRCA1[8]和BRCA2參與,這些蛋白在DNA損傷處形成聚集點(diǎn)(foci);另一種是NHEJ,斷裂的DNA末端重新連接,可以在沒有模板的情況下進(jìn)行DNA修復(fù),但也更容易發(fā)生錯誤,主要依賴Ku70/80異二聚體[9]與DNA依賴的蛋白激酶催化亞單位(DNA-PKcs)[10]結(jié)合形成DNA-PK全酶,后者募集XRCC4[11]和DNA連接酶Ⅳ完成NHEJ修復(fù)。DNA修復(fù)能力異常激活和增強(qiáng)是導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎(chǔ);相反,修復(fù)缺陷則使腫瘤對其高敏感。因此,干擾鼻咽癌細(xì)胞DNA修復(fù)很可能增敏基于DNA損傷的鼻咽癌放化療作用。

本實(shí)驗(yàn)中使用的依托泊苷(VP-16)是鬼臼毒素[3]的半合成衍生物,可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生DNA雙鏈損傷,臨床上廣泛用于治療急性粒細(xì)胞白血病等惡性腫瘤。在真核細(xì)胞中,外源性化學(xué)、物理及生物性物質(zhì)所致的DSB都可能會觸發(fā)H2AX的快速磷酸化,從而形成γ-H2AX。實(shí)驗(yàn)研究中,γ-H2AX可通過Western blotting法檢測,或應(yīng)用免疫熒光技術(shù),可以清楚地觀測到以γ-H2AX焦點(diǎn)形成為特征的DNA雙鏈斷裂的區(qū)域,這種染色質(zhì)的改變通常被認(rèn)為是細(xì)胞對DSB做出的敏感反應(yīng)。目前,γ-H2AX的水平已經(jīng)成為公認(rèn)的DSBs發(fā)生早期的標(biāo)志[12]。因此本實(shí)驗(yàn)用高內(nèi)涵技術(shù)檢測γ-H2AX焦點(diǎn)情況來判斷DNA損傷水平。

Capn4(又稱CapnS1)是calpain蛋白的一個(gè)小分子調(diào)節(jié)亞基,在調(diào)節(jié)calpain的穩(wěn)定性和活性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。多項(xiàng)研究表明Capn4的缺失引起calpain-1和calpain-2功能障礙。在轉(zhuǎn)基因小鼠中的研究顯示敲除Capn4基因可顯著降低calpain活性,從而影響小鼠的正常發(fā)育,導(dǎo)致胚胎早期死亡;敲除Capn4 能降低成纖維細(xì)胞的遷移和黏附能力。最近的研究報(bào)道Capn4在肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌中高表達(dá)[13，14],而且Capn4表達(dá)程度與患者的預(yù)后密切相關(guān)。干擾Capn4的表達(dá)能夠顯著降低肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌的細(xì)胞侵襲和遷移能力。本課題組前期工作表明,無論是在mRNA水平還是在蛋白水平,新鮮細(xì)針穿刺活檢鼻咽癌組織中的Capn4表達(dá)要明顯高于正常鼻咽組織。而且,EB病毒感染者Capn4陽性表達(dá)率高于無EB病毒感染;腫瘤分化程度越高,Capn4的陽性表達(dá)率越低;腫瘤分期越晚,Capn4的陽性表達(dá)率越高;出現(xiàn)遠(yuǎn)處及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性表達(dá)率要明顯高于未轉(zhuǎn)移的。Kaplan-Meier生存期分析顯示Capn4在鼻咽癌中表達(dá)的程度與鼻咽癌患者的預(yù)后密切相關(guān),Capn4高表達(dá)的患者總生存期、無進(jìn)展生存期均低于低表達(dá)者。從而表明Capn4在鼻咽癌惡性生物學(xué)行為中起著重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,下調(diào)Capn4的表達(dá)對VP-16誘導(dǎo)的CNE2細(xì)胞DNA損傷修復(fù)有抑制作用,而這種抑制作用可能是通過抑制NHEJ通路完成的。有報(bào)道顯示[15],鈣離子內(nèi)流能使m-Calpain從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到胞核,從而水解Ku80,裂解的Ku80能夠促進(jìn)DNA雙鏈斷裂的修復(fù)活性。故而轉(zhuǎn)位的m-Calpain通過Ku80的裂解促進(jìn)了NHEJ通路修復(fù)。這一結(jié)論與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。而Capn4與NHEJ修復(fù)通路上哪些蛋白相互作用以及是否影響細(xì)胞周期蛋白尚待進(jìn)一步研究。Capn4的抑制可能成為鼻咽癌放化療后抑制DNA損傷修復(fù)的重要因素。

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Effect of Capn4 on DNA damage repair of nasopharyngeal carcinoma cell CNE2 induced by VP-16

WANG Feng1,WANG Hui2,WU Lixian2,ZHENG Ming2*

(1CollegeofIntegrativeMedicine,FujianUniversityofTCM,Fuzhou350004,China;2DepartmentofPharmacology,FujianMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:zming_1956@163.com)

ObjectiveTo investigate the effect of Capn4 on the repair of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2 induced by VP-16 and its possible pathways.MethodsThe Capn4 knockdown CNE2 cells using shRNA were constructed and further identified by Western blot. ArrayScan High-Content Systems were used to analyze the mean fluorescence intensity of γ-H2AX in CNE2 cells and CNE2 cells with down-regulation of Capn4. Non-homologous end joining(NHEJ) pathway-specific plasmid EJ5-GFP was transfected into CNE2 cells and CNE2 cells with down-regulated Capn4 by Fugen6 HD. The positive rate of GFP was detected by ArrayScan High-Content Systems. And the effect of Canp4 down-regulation on VP-16-induced DNA damage NHEJ pathway in CNE2 cells was observed.ResultsThe shRNA inhibited Capn4 expression in CNE2 cells. After treated with 2.5 μmol/L VP-16 for 6 h and 12 h, the damages of CNE2Capn4 (-)cells were higher than those of CNE2Vectorcells. Down-regulation of Capn4 expression inhibited the DNA damage of CNE2 cells induced by VP-16(P<0.01).Compared with CNE2Vectorcells, the GFP average fluorescence intensity of the CNE2Capn4 (-)cells after treated with 2.5 μmol/L VP-16 was significantly lower. Down-regulation of Capn4 expression inhibited the repair of NHEJ pathway in CNE2 cells after DNA damage(P<0.01).ConclusionDown-regulation of Capn4 expression can inhibit radiation-induced DNA damage repair, which may be achieved by inhibition of NHEJ pathway.

Capn4; nasopharyngeal carcinoma; VP-16; shRNA; NHEJ pathway

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81572662)

王豐,女,1979-02生，碩士,講師,E-mail:fangfei1931@126.com

2017-03-26

R739.6

A

1007-6611(2017)07-0685-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.010