代 蕊， 劉 春 瑩， 徐 龍 權(quán)， 林 完 澤， 魚 紅 閃

( 1.大連工業(yè)大學 生物工程學院， 遼寧 大連 116034；2.韓京國立大學 生命科學學院， 京畿道 安城 456-749 )

白頭翁皂苷糖基水解Ⅱ型酶的分離純化及酶性質(zhì)

代 蕊1， 劉 春 瑩1， 徐 龍 權(quán)1， 林 完 澤2， 魚 紅 閃1

( 1.大連工業(yè)大學 生物工程學院， 遼寧 大連 116034；2.韓京國立大學 生命科學學院， 京畿道 安城 456-749 )

對Absidiasp. P39r所產(chǎn)白頭翁皂苷糖基水解Ⅱ型酶(PSGaseⅡ)進行分離純化，得到電泳純酶蛋白，對其酶學性質(zhì)以及該酶對底物的催化反應(yīng)過程進行了研究。結(jié)果表明，該酶蛋白的分子質(zhì)量為56 ku，最適反應(yīng)pH為4.0，在pH 3.0～7.0酶活力穩(wěn)定；最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在20～40 ℃酶活力穩(wěn)定；金屬離子Na+、K+、Mg2+對酶反應(yīng)無顯著影響，而Fe3+、Cu2+、Zn2+對其有較強的抑制作用。酶反應(yīng)動力學參數(shù)Km為19.60 mmol/L，vmax為21.60 mmol/(L·h)。PSGaseⅡ?qū)Π最^翁皂苷PSⅠ的催化反應(yīng)過程結(jié)果表明反應(yīng)是分步進行的，PSGaseⅡ以白頭翁皂苷PSⅠ為底物，先催化降解為中間產(chǎn)物白頭翁皂苷PSⅡ，繼續(xù)催化反應(yīng)，最終生成白頭翁皂苷A。

白頭翁皂苷；水解酶；酶性質(zhì)

0 引 言

白頭翁具有清熱解毒、燥濕殺蟲等功效[1]，近年來，其增強系統(tǒng)免疫及抗腫瘤作用成為研究熱點[2]。對白頭翁的成分研究最多的是白頭翁皂苷，其為白頭翁的主要化學成分[3]，天然存在的白頭翁皂苷大多含有多個糖基[4]，進入人體后需要被腸道內(nèi)微生物轉(zhuǎn)化為低糖基皂苷后可被人體吸收利用，若在體外實現(xiàn)這一過程，可提高皂苷的生物活性和利用度[5]。研究表明，生物酶法相對于化學法水解糖基更加溫和，加之選擇性較高，副產(chǎn)物少，成為主要的轉(zhuǎn)化方法[6]。

目前，對于白頭翁皂苷的研究主要集中在抗菌、抗阿米巴原蟲、抗其他病原體等藥理學方面[7-9],對白頭翁皂苷糖基水解酶水解多糖基皂苷的研究較少。在前期研究中，篩選到Absidiasp. P39r菌，發(fā)酵產(chǎn)粗酶液可將六糖基的白頭翁皂苷H3轉(zhuǎn)化為二糖基的白頭翁皂苷A[10]。對該菌產(chǎn)粗酶液進行分離純化，得到分子質(zhì)量為40 ku的電泳純酶蛋白[5]，后期進一步的研究發(fā)現(xiàn)，40 ku的酶只是將白頭翁皂苷H3轉(zhuǎn)化為五糖基的白頭翁皂苷(PSⅠ)，而最終產(chǎn)物白頭翁皂苷A是以PSⅠ為底物，在另一種酶的催化下轉(zhuǎn)化而來。為便于區(qū)分，實驗室暫命名40 ku的酶為白頭翁皂苷糖基水解Ⅰ型酶(PSGaseⅠ)，以PSⅠ為底物催化反應(yīng)生成白頭翁皂苷A的酶為白頭翁皂苷糖基水解Ⅱ型酶(PSGaseⅡ)。

本實驗針對PSGaseⅡ進行分離純化，對其酶學性質(zhì)和該酶對底物的催化反應(yīng)進行研究，進一步闡明多糖基白頭翁皂苷酶水解生成最終產(chǎn)物的反應(yīng)過程，為今后進一步研究白頭翁皂苷H3催化轉(zhuǎn)化為白頭翁皂苷A的雙酶協(xié)同反應(yīng)機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

Absidiasp. P39r，大連工業(yè)大學生物工程學院菌種保藏室。

1.1.2 試劑與儀器

3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，暫命名為白頭翁皂苷PSⅠ；3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元28-O-β-D-吡喃葡萄糖酯苷，暫命名為白頭翁皂苷PSⅡ；3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤皂苷元，白頭翁皂苷A，均為本實驗室制備[11]。

低分子質(zhì)量標準蛋白，北京索萊寶科技有限公司；所有試劑均為分析純。JM-250蛋白電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；薄層層析，Silica Gel-60F254，德國Merck公司。

1.2 方 法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

白頭翁粉80 g，加水400 mL，水浴6 h；過濾，4 ℃、8 000 r/min離心8 min。將離心得到的上清液補水至300 mL備用。

將4 mL白頭翁浸出液與16 mL 6°麥汁混勻，制成PSGaseⅡ液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.2 產(chǎn)酶菌株的發(fā)酵及粗酶液的提取

將Absidiasp. P39r菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)條件為30 ℃、150 r/min。

將發(fā)酵好的菌體培養(yǎng)基于4 ℃、7 000 r/min離心10 min去除菌體，在4 ℃磁力攪拌條件下，緩慢加入研磨好的硫酸銨粉末，至75%飽和度。將飽和溶液于4 ℃保存12 h，12 000 r/min離心20 min。收集得到蛋白沉淀，并用20 mmol/L pH 5.0的HAc-NaAc緩沖液將沉淀溶解。對該溶液進行透析，每隔4 h換一次透析液，透析24 h。將透析液離心8 min，離心條件為4 ℃、7 000 r/min。得到的上清液即為粗酶液，放入4 ℃ 冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 粗酶的分離純化

采用DEAE-Cellulose DE52陰離子交換柱(Φ2 cm×12 cm)對粗酶液進行分離純化。用100 mL pH 5.0的HAc-NaAc緩沖液洗脫12 mL 粗酶液，再分別用60、90、120、150、180 mmol/L的氯化鉀溶液進行梯度洗脫，自動分部收集器收集洗脫液，每3 min收集一管，每管3 mL。洗脫液在280 nm紫外光下測定OD。

1.2.4 酶蛋白分子質(zhì)量的測定

采用SDS-PAGE法測定提純酶的純度及分子質(zhì)量。所選用標準蛋白為磷酸酶b(97.4 ku)、牛血清蛋白(66.2 ku)、肌動蛋白(43 ku)、碳酸酐酶(31 ku)、胰蛋白酶抑制(22 ku)、溶菌酶(14.4 ku)。

1.2.5 酶活力的測定

利用TLC法對酶活力進行檢測。將2 mg白頭翁皂苷PSⅠ用1 mL 20 mmol/L的pH 5.0的HAc-NaAc緩沖液溶解，配制成2 mg/mL的底物。取100 μL PSGaseⅡ與底物等體積充分混合，40 ℃條件下反應(yīng)24 h后，加入200 μL水飽和正丁醇終止反應(yīng)，離心取上層液體作為TLC檢測的樣品，展開劑為體積比6.5∶4.5∶0.5的氯仿-甲醇-水溶液，10%硫酸顯色。通過BandScan軟件對酶反應(yīng)產(chǎn)物進行定量分析。酶活力定義：在40 ℃條件下，每小時水解1 μmol底物所需的酶量為一個酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗酶液酶活力檢測

將Absidiasp. P39r產(chǎn)酶菌發(fā)酵得到的含有PSGaseⅡ的粗酶液進行酶活力檢測。取100 μL PSGaseⅡ與等體積2 mg/mL的白頭翁皂苷PSⅠ混合，在40 ℃下反應(yīng)24 h后，用TLC檢測，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看到，粗酶液可將底物PSⅠ轉(zhuǎn)化生成最終產(chǎn)物白頭翁皂苷A和少量白頭翁皂苷PSⅡ，具有較強的酶活力。說明提取的粗酶液中含有較高活力的PSGaseⅡ，可用于離子交換柱層析法進行純化。

圖1 TLC檢測含有PSGaseⅡ的粗酶液酶活力

2.2 粗酶的分離純化

按“1.2.3”的方法對粗酶進行分離純化，取每個洗脫梯度的出峰試管酶液進行酶反應(yīng)后，利用150 mmol/L氯化鉀溶液對洗脫酶液進行酶反應(yīng)，TLC檢測結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，109號收集管中的酶液具有較好的酶活力，可以更加徹底地對底物進行水解，得到更多的反應(yīng)產(chǎn)物。

S，底物；107～111，收集管編號

2.3 PSGaseⅡ純度檢測及其分子質(zhì)量的測定

利用SDS-PAGE法對分離純化得到的109號收集管的酶液進行純度檢測及分子質(zhì)量測定，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，第109號收集管為電泳單帶，可認定其為電泳純的PSGaseⅡ。

圖3 純化的PSGaseⅡ SDS-PAGE圖

由圖3的標準蛋白及其相對遷移率繪制出蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準曲線，得到回歸方程lgY=2.085 0-1.030 6X，將PSGaseⅡ在電泳圖中的相對遷移率代入回歸方程，計算出其分子質(zhì)量約為56 ku。

2.4 酶學性質(zhì)

2.4.1 溫度對酶反應(yīng)的影響

取100 μL PSGaseⅡ與2 mg/mL白頭翁皂苷PSⅠ等體積混合，在pH為5的條件下，分別置于20、30、40、50、60、70、80 ℃的恒溫箱中，反應(yīng)24 h后，繪制最適反應(yīng)溫度曲線。

取100 μL PSGaseⅡ分別置于20、30、40、50、60、70、80 ℃條件下保存1 h，冷卻至室溫，與2 mg/mL 白頭翁皂苷PSⅠ等體積混合，置于40 ℃ 恒溫箱中，反應(yīng)24 h后，繪制溫度的穩(wěn)定性曲線。

PSGaseⅡ的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性曲線如圖4所示。由圖4可以看出，PSGaseⅡ在20～40 ℃，隨著溫度的升高酶活性增強，在40 ℃時達到最高，之后隨著溫度的升高酶活力下降。因此PSGaseⅡ的最適溫度是40 ℃，在20～40 ℃保持穩(wěn)定。

2.4.2 pH對酶反應(yīng)的影響

將2 mg/mL的白頭翁皂苷PSⅠ與100 μL PSGaseⅡ等體積混合，將反應(yīng)體系的pH分別調(diào)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。在40 ℃ 的恒溫箱中反應(yīng)24 h，繪制最適反應(yīng)pH曲線。

圖4 PSGaseⅡ的最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性曲線

Fig.4 The curves of optimum temperature and temperature stability of PSGaseⅡ

將PSGaseⅡ分別在pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的條件下，置于4 ℃保存1 h，與2 mg/mL的白頭翁皂苷PSⅠ等體積混合，置于40 ℃恒溫箱中，反應(yīng)24 h后，繪制pH穩(wěn)定性曲線。

PSGaseⅡ的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性曲線如圖5所示。

圖5 PSGaseⅡ的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性曲線

由圖5可以看出，PSGaseⅡ在pH 3.0～7.0，酶活力較高，在pH為4.0時達到最高，所以PSGaseⅡ的最適pH為4.0，在pH 3.0～7.0酶活性穩(wěn)定。

2.4.3 金屬離子對酶反應(yīng)的影響

分別向PSGaseⅡ與2 mg/mL的白頭翁皂苷PSⅠ等體積混合反應(yīng)體系中加入5、10、50、100、200 mmol/L的K+、Mg2+、Na+、Fe3+、Cu2+、Zn2+，根據(jù)方法“1.2.5”測定其酶活力，結(jié)果如表1所示。由表1可看出，K+、Mg2+、Na+對酶活力影響較??；Fe3+、Cu2+、Zn2+在濃度較低時影響較小，隨著濃度的升高抑制作用逐漸增強。

表1 金屬離子對相對酶活力的影響

2.4.4 PSGaseⅡ的酶反應(yīng)動力學方程

配制不同濃度的底物與等體積的PSGaseⅡ在40 ℃、pH 5.0條件下反應(yīng)1 h，采用Lineweaven-Burk 作圖，得到PSGaseⅡ的米氏方程：1/v=2.78+54.4/S，Km=19.60 mmol/L，vmax=21.60 mmol/(L·h)。

2.5 PSGaseⅡ?qū)Π最^翁皂苷PSⅠ的催化反應(yīng)

取1 mL PSGaseⅡ與2 mg/mL白頭翁皂苷PSⅠ等體積混合，在40 ℃下分別反應(yīng)4、8、12、16、18、22、24 h，進行TLC檢測，結(jié)果如圖6所示。

圖6 白頭翁皂苷PSⅠ的酶反應(yīng)TLC結(jié)果

由圖6可看出，PSGaseⅡ?qū)Φ孜锇最^翁皂苷PSⅠ的催化反應(yīng)過程中，經(jīng)過4 h時，PSⅠ并沒有明顯的轉(zhuǎn)化；反應(yīng)到8 h時，有微量PSⅠ轉(zhuǎn)化為白頭翁皂苷PSⅡ；反應(yīng)12 h時，50%左右的PSⅠ 轉(zhuǎn)化生成白頭翁皂苷PSⅡ；反應(yīng)16 h時，80%的PSⅠ轉(zhuǎn)化為白頭翁皂苷PSⅡ和少量白頭翁皂苷A；反應(yīng)18 h時，PSⅠ全部被轉(zhuǎn)化生成PSⅡ 和白頭翁皂苷A，其中PSⅡ的生成量明顯減?。环磻?yīng)進行到22 h時，PSⅠ全部被轉(zhuǎn)化生成終產(chǎn)物白頭翁皂苷A；到24 h，PSⅠ的轉(zhuǎn)化終產(chǎn)物白頭翁皂苷A有少量的增加。

由此可見，PSGaseⅡ催化底物白頭翁皂苷PSⅠ，先水解白頭翁皂苷PSⅠ的28-O-末端葡萄糖基和3-O-末端葡萄糖基生成中間過渡產(chǎn)物白頭翁皂苷PSⅡ，再進一步水解白頭翁皂苷PSⅡ的28-O-葡萄糖酯鍵，生成終產(chǎn)物白頭翁皂苷A。

3 結(jié) 論

經(jīng)Absidiasp. P39r菌株發(fā)酵，得到了含有PSGaseⅡ高活力的粗酶液，利用DEAE-Cellulose DE52陰離子交換柱分離純化得到了電泳純的PSGaseⅡ，確定了該酶的分子質(zhì)量為56 ku。該酶的最適反應(yīng)pH為4.0，在pH 3.0～7.0較穩(wěn)定。最適反應(yīng)溫度為40 ℃，在20～40 ℃條件下酶活力相對穩(wěn)定。金屬離子K+、Mg2+、Na+對酶反應(yīng)無顯著影響；而Fe3+、Cu2+、Zn2+對其有較強的抑制作用。動力學方程為1/v=2.78+54.4/S，Km=19.60 mmol/L，vmax=21.60 mmol/(L·h)。PSGaseⅡ 對底物的催化反應(yīng)過程分兩步進行：以白頭翁皂苷PSⅠ為底物，先催化降解兩分子葡萄糖，形成中間過渡產(chǎn)物白頭翁皂苷PSⅡ，然后繼續(xù)催化降解28-O-末端酯鍵上的一分子葡萄糖，最終生成白頭翁皂苷A。

從TLC圖譜可以看到，PSGaseⅡ轉(zhuǎn)化底物白頭翁皂苷PSⅠ的效率很高，22 h能將底物徹底轉(zhuǎn)化成低糖基的白頭翁皂苷A。酶反應(yīng)過程研究表明，該酶既能水解葡萄糖苷鍵，也能水解葡萄糖酯鍵，對于這種特異性的水解酶，其反應(yīng)機制還有待于在分子水平進行更深入的研究。

[1] 楊宇,王東明,金鳳燮,等.白頭翁皂苷糖苷酶的純化及其酶學性質(zhì)[J].大連工業(yè)大學學報,2009,28(6):404-407.

[2] 劉琳,金鳳燮.白頭翁皂苷的分離提純[J].大連輕工業(yè)學院學報,2004,23(1):18-21.

[3] 金鳳燮.天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化[M].北京:化學工業(yè)出版社,2009.

[4] 安家彥,王東明,劉春瑩,等.白頭翁皂苷酶產(chǎn)物促進皮膚纖維芽細胞的膠原蛋白合成[J].大連工業(yè)大學學報,2013,32(2):79-81.

[5] 林迪,金鳳燮,魚紅閃.白頭翁皂苷H3糖苷酶的分離純化及酶性質(zhì)[J].大連工業(yè)大學學報,2015,34(6):401-403.

[6] 林章澟,曹竹安,邢新會.工業(yè)生物催化技術(shù)[J].生物加工過程,2003,35(1):12-16.

[7] 張小愚,王偉,劉琳,等.單糖基白頭翁皂苷的分離純化[J].大連輕工業(yè)學院學報,2006,25(2):79-82.

[8] 劉美正,郭忠武,惠永正.皂甙研究新進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),1997,9(2):81-85.

[9] 潘新社,張宏利,韓崇選,等.白頭翁生物活性研究現(xiàn)狀及展望[J].西北農(nóng)業(yè)學報,2004,13(4):160-164.

[10] KANG S S, KIM S J, KIM H Y, et al. A triterpenoid saponin fromPatriniascabiosaefolia[J]. Journal of Natural Products, 1997, 60: 1060-1062.

[11] 張慶文,葉文才,車鎮(zhèn)濤,等.朝鮮白頭翁的三萜皂苷成分研究[J].藥學學報,2000,35(10):756-759.

Purification and properties of pulchinenoside glycosyl hydrolase Ⅱ

DAI Rui, LIU Chunying, XU Longquan, LIN Wanze, YU Hongshan

( 1.School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.School of Life Science, Hankyong National University, Anseong 456-749, Korea )

The pulchinenoside glycosyl hydrolase Ⅱ (PSGaseⅡ) fromAbsidiasp. P39r was purified and characterized. Its molecular weight was 56 ku. The optimum pH was at pH 4 and the enzyme was stable at pH 3.0-7.0. The optimum temperature was 40 ℃ and the enzyme was stable at 20-40 ℃. Ions Na+, K+and Mg2+had no effects on the enzyme activity of PSGaseⅡ, but Fe3+, Cu2+and Zn2+had strong inhibitory effects on the enzyme reaction. Under the optimum conditions,Kmwas 19.60 mmol/L and the maximum reaction rate was 21.60 mmol/(L·min). Pulchinenoside PSⅠ was enzymatic hydrolyzed to pulchinenoside PSⅡ and then to pulchinenoside A by PSGaseⅡ.

pulchinenoside; hydrolase; enzyme properties

2015-12-18.

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2012ZX09503001-003)；國家高端外國專家項目(GDT20152100019).

代 蕊(1990-)，女，碩士研究生；通信作者：魚紅閃(1968-)，男，教授.

TS201.2；Q556.2

A

1674-1404(2017)04-0245-05

代蕊,劉春瑩,徐龍權(quán),林完澤,魚紅閃.白頭翁皂苷糖基水解Ⅱ型酶的分離純化及酶性質(zhì)[J].大連工業(yè)大學學報,2017,36(4):245-249.

DAI Rui, LIU Chunying, XU Longquan, LIN Wanze, YU Hongshan. Purification and properties of pulchinenoside glycosyl hydrolase Ⅱ[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(4): 245-249.