葉學(xué)敏，于雪丹，付其迪，鄭勇奇，張川紅

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091)

血皮槭葉綠體DNA非編碼區(qū)差異序列篩選和分析

葉學(xué)敏，于雪丹，付其迪，鄭勇奇，張川紅*

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091)

[目的]篩選出高變異率的葉綠體DNA序列，以進行血皮槭天然群體的譜系地理學(xué)研究。[方法]以血皮槭16個天然群體為試材，對葉綠體基因組20個非編碼區(qū)序列進行測序研究，并利用篩選出的高變異率cpDNA序列初步分析了其遺傳變異。[結(jié)果]序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示血皮槭cpDNA種內(nèi)變異非常低，9個cpDNA序列檢測到不同程度的變異位點，其中只有4個序列psbJ-petA、ndhF-rpl32、trnD-trnT和trnH-psbA表現(xiàn)出較高的變異水平。[結(jié)論]篩選出的4個高變異率cpDNA序列，可以在分子水平上研究血皮槭種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育、遺傳變異和種群歷史動態(tài)，為進一步研究瀕危種血皮槭的分子譜系地理學(xué)奠定基礎(chǔ)。

血皮槭；cpDNA；序列篩選；序列比對；系統(tǒng)發(fā)育分析

血皮槭(Acergriseum(Franch.)Pax)為中國特有種，具有極高的觀賞價值。1993年，血皮槭獲得英國皇家園藝學(xué)會園藝獎，成為國內(nèi)外著名的景觀樹種[1]。除觀賞價值外，血皮槭的許多價值尚待開發(fā)和利用，例如木材堅硬，可作為良好的建筑材料；木材紋理精美可制作樂器及工藝品。但是，這個極具開發(fā)價值的樹種正瀕臨滅絕，急需保護。血皮槭的分布范圍僅限于我國中部地區(qū)海拔800～2 000 m的山地，分布區(qū)嚴(yán)重片段化，天然群體數(shù)量非常小，表現(xiàn)出瀕危物種的典型特征[2]。根據(jù)世界自然保護聯(lián)盟(IUCN)的標(biāo)準(zhǔn)，血皮槭在《中國物種紅色目錄》中已被列為瀕危樹種(EN A2c)[3]。

植物葉綠體基因組DNA(Chloroplast DNA，cpDNA)的研究為珍稀瀕危物種制定合理有效的保護策略提供了重要的理論依據(jù)。通常，葉綠體非編碼區(qū)的堿基替換率較高，為中性突變，不受自然選擇等其它因素的影響，是研究植物譜系地理、分子系統(tǒng)發(fā)育和群體遺傳學(xué)重要的工具，近年來被成功用于種間或種內(nèi)變異水平的研究[4]。例如，利用cpDNA序列對瀕危植物南方紅豆杉(Taxuswallichianavar.mairei(Lemée& H.Léveillé) L. K. Fu & Nan Li)，日本紅楓(AcerpycnanthumK. Koch)，癭椒樹(TapisciasinensisOliv.)，青錢柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.)，珙桐(DavidiainvolucrataBaill.)，金錢槭(DipteroniasinensisOliv.)等植物[5-10]開展了譜系地理學(xué)研究。近年來，對于瀕危植物血皮槭的研究主要集中在SSR引物開發(fā)、天然群體遺傳變異和譜系地理學(xué)初步研究等方面[11-13]，其中王佳慧利用rps16序列對血皮槭譜系地理學(xué)進行初步探討取得進展。但是一個序列并不能全面反映血皮槭的譜系地理結(jié)構(gòu)，本研究利用20個通用cpDNA序列，以血皮槭16個天然群體的16株個體為材料，篩選適宜于血皮槭種內(nèi)研究的高變異率cpDNA非編碼區(qū)序列，為進一步研究瀕危種血皮槭的分子譜系地理學(xué)奠定基礎(chǔ)，對于制定血皮槭合理的保護策略具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于本課題組野外調(diào)查的16個血皮槭天然群體(表1)，每個群體隨機選取1株個體為試材。新鮮葉片經(jīng)硅膠充分干燥后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 血皮槭各采樣群體的地理位置

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測 取干燥葉片30 mg，采用DNA提取試劑盒DP305 (Tiangen Biotech Co., China) 提取血皮槭葉片總DNA。采用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，G-box凝膠成像儀(Chemi XX6，Syngene)拍照檢測DNA的質(zhì)量，酶標(biāo)儀(Spectra Max i3)檢測DNA純度和濃度。DNA濃度稀釋到50 ng·μL-1，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cpDNA通用引物篩選及測序 從參考文獻(xiàn)[14-17]挑選了20對適合種內(nèi)水平的cpDNA非編碼通用引物，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成(表2)。為對20對通用引物進行初步篩選，隨機挑選2個樣品進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL，包括模板DNA 50 ng、2×Buffer Master Mix 10 μL、10 μmol·L-1F-primer 0.4 μL、10 μmol·L-1R-primer 0.4 μL、其余ddH2O補齊。NdhF-rpl32，psbJ-petA序列的PCR程序：80℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，50℃退火1 min，0.3℃·s-1升溫到65℃，65℃延伸4 min，30個循環(huán)；65℃延伸5 min。其他序列的PCR程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠檢測，篩選出條帶清晰單一的引物；然后利用初篩合格的引物對所有樣品進行PCR擴增，選擇條帶清晰明亮、無非特異性擴增的PCR擴增產(chǎn)物，送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司純化，然后采用ABI 3730xl DNA analyzer進行測序。

表2 20對cpDNA通用引物序列

1.2.3 cpDNA序列編輯和分析 根據(jù)原始峰圖，使用Contig Express軟件(Informax Inc.，North Bethesda，MD，USA)對cpDNA測序結(jié)果進行峰圖檢查及拼接，手工校對。然后，采用BioEdit v7.0.5.2軟件[18]分別對cpDNA序列進行比對和手工調(diào)整；利用MEGAv5.0[19]計算信息位點。cpDNA序列的變異位點，都是潛在的信息位點(PICs)，包括核苷酸的替換、倒置、插入和缺失[11]。利用MEGA v5.0進行聚類分析，采用鄰接法(Neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展檢驗(bootstrap)通過1 000次重復(fù)獲得。為獲得血皮槭潛在信息位點(PICs)和變異率(V)，引入公式：

PICs=I+S+R

(1)

(2)

式(1)、(2)中：I表示序列插入和缺失數(shù)，S表示序列核苷酸替換數(shù)，R表示序列倒置數(shù)，A表示序列比對后長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取與PCR擴增

酶標(biāo)儀檢測提取的DNA純度和濃度都較高。OD260/OD280為1.606～1.992，DNA濃度為42.8～154.2 ng·μL-1，符合PCR反應(yīng)所需的要求。電泳結(jié)果顯示DNA條帶清晰，滿足后續(xù)試驗要求。

2.2 序列分析

所有20對cpDNA通用引物都能擴增出目的片段。其中9個cpDNA序列(表2編號1-9)檢測到不同程度的變異位點(表3)，序列(表2編號5-9)只檢測到一個位點的變異(數(shù)據(jù)省略)。其余11個cpDNA序列(表2編號10-20)未能檢測到變異位點。

表3 4個cpDNA序列在血皮槭群體中的變異位點分布

注：“△”：TAACTCCGAAATACAAAAAAGAGAGAGAGATAGAAAGGTATCACAAA；“◇”： TTCTTTCACT；“☆”：TAATAAA；“-”：缺失

Note： “△”：TAACTCCGAAATACAAAAAAGAGAGAGAGATAGAAAGGTATCACAAA；“◇”： TTCTTTCACT；“☆”：TAATAAA；“-”：deletion.

圖1 血皮槭cpDNA非編碼區(qū)序列的PICs值和變異率Fig.1 PICs values and sequence variation of Non-coding cpDNA sequences in A. griseum

對9個序列的PICs值和變異率(圖1)進行比較，篩選出4個變異豐富的cpDNA序列，按照PICs值由高到低依次為ndhF-rpl32，psbJ-petA，trnH-psbA，trnD-trnT，變異率由高到低依次為trnH-psbA，ndhF-rpl32，psbJ-petA，trnD-trnT。

血皮槭cpDNA非編碼區(qū)序列的種內(nèi)變異(PICs值)與其他木本植物相比很低(見表4)。rps12-rpl20和rpl32-trnL序列在血皮槭中表現(xiàn)無變異，而在傘花木[20](Eurycorymbuscavaleriei(Le′vl.) Rehd. et Hand.-Mazz.)群體和珙桐[9](D.involucrata)群體檢測到不同程度的變異；trnH-psbA，atpB-rbcL，ndhF-rpl32和psbJ-petA序列在血皮槭中的PICs值與其他木本植物如色木槭[21](AcermonoMaxim.)、紅楓[22](AcerrubrumL.)、美洲糖槭[23](AcersaccharumMarsh.)和觀光木[24](Micheliaodora)相比很低。

表4 各樹種不同cpDNA序列PICs值比較

注：括號內(nèi)的數(shù)字為核苷酸替換數(shù)

Note：The number in parentheses represents the number of nucleotide substitutions

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

基于4個序列ndhF-rpl32，psbJ-petA，trnH-psbA和trnD-trnT的比對結(jié)果，構(gòu)建了血皮槭群體的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。此系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，16個群體明顯分為兩大支，SNJ、WX、ZJJ、TPZ、TS、TBS、YL、WF、CHK、HPS、SX、XS群體聚為一支，LC、YC、HS、NX群體聚為一支。SNJ、WX群體和NX群體分別從兩大支單獨分離出來。位于大巴山脈東部的重慶巫溪(WX)和湖北神農(nóng)架(SNJ)同聚為一支，位于秦嶺山脈東部的河南欒川(LC)和內(nèi)鄉(xiāng)(NX)、山西陽城(YC)和陜西華山(HS)群體聚為一支。

3 討論

圖2 血皮槭基于4個cpDNA片段的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(群體的代碼見表1)Fig.2 NJ phylogenetic tree based on 4 cpDNA seqences of A. griseum(population codes are shown in Table 1)

與其他一些木本植物相比，血皮槭種內(nèi)變異率較低。血皮槭的種內(nèi)變異率較低的原因可能與只選用了較少的16個樣品用于cpDNA序列篩選有關(guān)，在植物的譜系地理學(xué)研究中，天然群體的數(shù)量非常重要，樣本數(shù)量越多越能全面反映其遺傳變異情況；也可能與血皮槭及天然群體分布范圍窄且呈片段化分布的特點有關(guān)，一般來說，廣域分布的物種比狹域分布的物種擁有更豐富的遺傳變異。例如廣域分布的槭屬植物如色木槭和糖槭的cpDNA序列變異率比狹域分布的日本紅楓和血皮槭高很多。

通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析，16個群體明顯分為兩大支，而且兩個分支內(nèi)群體間地理距離較近，推測這兩個分支的群體經(jīng)歷了長期的地理隔離，與其它群體之間缺乏有效的基因流。ZJJ、TPZ、TS、TBS、YL、WF、CHK、HPS、SX和XS群體位于秦嶺山脈、大巴山脈和武陵山脈，此區(qū)域位于華中地區(qū)的中心，獨特的地形和復(fù)雜的氣候是眾多動植物的避難所，為物種的分化和地理隔離提供先決條件。此外，葉綠體基因流是通過種子進行母系傳播，基于血皮槭翅果種子傳播距離有限、空種率高和種子難以萌發(fā)等特性，加之惡劣生境的影響，限制了種子的傳播，阻斷了基因流，從而使血皮槭在區(qū)域內(nèi)分化和地理隔離成為可能。

4 結(jié)論

本研究通過對20個血皮槭葉綠體DNA非編碼區(qū)差異序列進行篩選，共篩選出4個多態(tài)性較好的序列(psbJ-petA、ndhF-rpl32、trnD-trnT和trnH-psbA)。利用篩選得到的4個cpDNA序列對血皮槭16個群體進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示16個群體應(yīng)分為兩大類。本研究篩選獲得的4個cpDNA序列在血皮槭種群內(nèi)擁有相對豐富的變異，是研究種內(nèi)變異良好的分子標(biāo)記，可以進一步用于血皮槭系統(tǒng)發(fā)育、遺傳變異和譜系地理學(xué)研究。

[1] 何曉燕, 包志毅. 英國引種家威爾遜引種中國園林植物種質(zhì)資源及其影響 [J]. 浙江林業(yè)科技, 2005, 25(3):56-61.

[2] Gibbs D, Chen Y. The Red List of Maples [M]. Botanic Gardens Conservation International，2009: 17.

[3] 汪 松，解 焱. 中國物種紅色目錄.第一卷.紅色目錄 [M].北京：高等教育出版社，2004.

[4] Shaw J, Shafer H L, Leonard O R,etal. Chloroplast DNA sequence utility for the lowest phylogenetic and phylogeographic inferences in angiosperms: The tortoise and the hare IV [J]. American Journal of Botany, 2014, 101(11):1987-2004.

[5] 張雪梅, 李德銖, 高連明. 南方紅豆杉譜系地理學(xué)研究 [J]. 西北植物學(xué)報, 2012, 32(10):1983-1989.

[6] Saeki I, Murakami N. Chloroplast DNA phylogeography of the endangered Japanese red maple (Acerpycnanthum): the spatial configuration of wetlands shapes genetic diversity [J]. Diversity & Distributions, 2009, 15(6):917-927.

[7] Zhang J, Li Z, Fritsch P W,etal. Phylogeography and genetic structure of a Tertiary relict tree species,Tapisciasinensis(Tapisciaceae): Implications for conservation [J]. Annals of Botany, 2015, 116 (5):727-737.

[8] Kou Y X, Cheng S M, Tian S,etal. The antiquity ofCyclocaryapaliurus(Juglandaceae) provides new insights into the evolution of relict plants in subtropical China since the late Early Miocene [J]. Journal Of Biogeography, 2016,43: 351-360.

[9] Ma Q, Du Y, Chen N,etal. Phylogeography ofDavidiainvolucrata(Davidiaceae) Inferred from cpDNA Haplotypes and nSSR Data [J]. Systematic Botany, 2015, 40(3): 796-810

[10] 柏國清. 金錢槭屬植物譜系地理學(xué)研究 [D]. 西安: 西北大學(xué), 2010.

[11] Sun S, Yu X D, Zheng Y Q,etal. Isolation and characterization of twenty-seven polymorphic microsatellite loci in endangered Chinese paperbark maple,Acergriseum, (Dicotyledoneae: Aceraceae)[J]. Biochemical Systematics & Ecology, 2014, 56(56):99-103.

[12] 孫 圣. 基于SSR標(biāo)記的血皮槭天然群體遺傳變異研究[D]. 北京: 中國林業(yè)科學(xué)研究院, 2014.

[13] 王佳慧. 特有瀕危種血皮槭天然群體生長狀況及分子譜系地理初步研究[D]. 北京: 中國林業(yè)科學(xué)研究院, 2015.

[14] Shaw J, Lickey E B, Schilling E E,etal. Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: The tortoise and the hare III [J]. American Journal of Botany, 2007, 94 (3): 275-288.

[15] Shaw J, Lickey E B, Beck J T,etal. The tortoise and the hare II: Relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis [J]. American Journal of Botany, 2005, 92:142-166.

[16] Wakasugi T, Tsudzuki J, Ito S,etal. A physical map and clone bank of the black pine (Pinusthunbergii) chloroplast genome [J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1994, 12(12):227-241.

[17] Golenberg E M, Clegg M T, Durbin M L. Evolution of a noncoding region of the chloroplast genome [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1993, 2(1):52-64.

[18] Hall T A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT [J]. In Nucleic acids symposium series，1999,41:95-98.

[19] Tamura K, Peterson D, Peterson N,etal. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood evolutionary distance and maximum parsimony methods [J]. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731-2739.

[20] Wang J, Gao P, Kang M,etal. Refugia within refugia: the case study of a canopy tree (Eurycorymbuscavaleriei) in subtropical China [J]. Journal of Biogeography, 2009.36: 2156-2164.

[21] Guo X D, Wang H F, Bao L,etal. Evolutionary history of a widespread tree speciesAcermonoin East Asia [J]. Ecology and Evolution, 2014, 4: 4332-4345.

[22] Ikuyo S, Dick C W, Barnes B V,etal. Comparative phylogeography of red maple (AcerrubrumL.) and silver maple (AcersaccharinumL.): Impacts of habitat specialization, hybridization and glacial history [J]. Journal of Biogeography, 2011, 38(5):992-1005.

[23] Vargas-Rodriguez Y L, Platt W J, Urbatsch L E,etal. Large scale patterns of genetic variation and differentiation in sugar maple from tropical Central America to temperate North America [J]. BMC Evolutionary Biology, 2014. 15: 1-14.

[24] 何長青. 觀光木譜系地理學(xué)研究[D]. 湖南: 中南林業(yè)科技大學(xué)，2015.

(責(zé)任編輯：張 研)

Differential Analysis of Non-coding Chloroplast DNA Sequences inAcergriseum

YEXue-min,YUXue-dan,FUQi-di,ZHENGYong-qi,ZHANGChuan-hong

(Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry; Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Beijing 100091, China)

[Objective]By screen highly variable cpDNA sequences to study the phylogeography ofAcergriseum. [Method] Twenty non-coding cpDNA sequences were sequenced. The genetic variation of sixteen natural populations inA.griseumwas preliminarily analyzed with the selected highly variable sequences. [Result] Sequences alignment and phylogenetic analysis showed that the intraspecific variation of cpDNA inA.griseumwas very low. Different variation were detected in some loci of nine cpDNA sequences and a relative high level of variation displayed in four sequencespsbJ-petA,ndhF-rpl32,trnD-trnT andtrnH-psbA. [Conclusion] The four selected highly variable cpDNA sequences could be used to study the phylogeny and genetic variation and clarify the history of population dynamics ofA.griseum. These sequences will lay a foundation for future phylogeographic study inA.griseum.

Acergriseum; cpDNA; sequences screening; sequences alignment; phylogenetic analysis

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.04.020

2016-11-03

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(CAFYBB2016MA001)。

葉學(xué)敏(1991—)，男，在讀碩士，主要從事植物譜系地理研究。E-mail:330584119@qq.com。

* 通訊作者：張川紅(1970—)，女，博士，副研究員，主要從事林木種質(zhì)資源研究。E-mail: zhangch@caf.ac.cn。

S718.46

A

1001-1498(2017)04-0674-05