任 婧，李景富，張 佳，劉俊芳，許向陽(yáng)，姜景彬

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150036)

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基于蒽酮硫酸比色法建立一種快速測(cè)定果糖含量的方法

任 婧，李景富，張 佳，劉俊芳，許向陽(yáng)，姜景彬

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150036)

利用蒽酮比色法對(duì)番茄果實(shí)果糖含量進(jìn)行測(cè)定，初步建立了微型化蒽酮比色法測(cè)定果糖含量的實(shí)驗(yàn)方法和蒽酮比色法測(cè)定番茄果糖含量的最佳條件，對(duì)影響測(cè)定結(jié)果的因素：測(cè)定波長(zhǎng)、顯色劑用量、顯色時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間，進(jìn)行了單因素試驗(yàn)。結(jié)果表明，620 nm波長(zhǎng)、85%硫酸含量、400 μL顯色劑、50℃水浴3 min為最佳測(cè)定條件。該最佳測(cè)定條件下，果糖含量在2～16 μg與吸光值呈良好的線性關(guān)系。利用得到優(yōu)化方法對(duì)4個(gè)番茄品種的果糖含量進(jìn)行了測(cè)定，回收率在102.32%～107.38%。本研究得到番茄果實(shí)果糖含量測(cè)定的優(yōu)化方法，是一種穩(wěn)定、高效可行的測(cè)定方法。

番茄；蒽酮比色法；微型化；果糖

番茄(Solanumlycopersicum)，茄科番茄屬，起源于北美洲的安第斯山地帶。不同品種的番茄成熟時(shí)積累不同比例的糖分，栽培品種一般主要積累葡萄糖和果糖，蔗糖含量極低[1]。積累果糖與葡萄糖的比例也不相同，果糖與葡萄糖的含量比值受一對(duì)顯性基因(Fgr)控制，F(xiàn)gr調(diào)控果糖和葡萄糖在己糖中的比例而不影響總糖含量[2]。番茄果實(shí)不同部位積累的糖分也不相同：果實(shí)維管束中果糖和葡萄糖含量較高，果肉、果膠質(zhì)和胎座及心室隔壁中果糖和葡萄糖含量相差不大[3]。也有一些品種除了綠熟期外，果皮中果糖量比果心的含量高[4]。

番茄果糖量是可溶性總糖的重要組成成分[5]。測(cè)定果糖含量的方法有多種，如高效液相色譜法[6]、蒽酮比色法[7]、半胱氨酸鹽酸鹽法[8]、鹽酸法[9]等，大多是利用紫外可見光吸收法，但這些方法存在一些明顯的缺點(diǎn)，如價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，不能進(jìn)行批量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蒽酮硫酸比色法測(cè)定番茄果糖含量的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，尋找最佳實(shí)驗(yàn)條件，以保證試驗(yàn)的精確度，獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為番茄育種提供參考。

本實(shí)驗(yàn)建立了微型化測(cè)定果糖含量的實(shí)驗(yàn)方法，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光值，對(duì)樣品的吸光值可以進(jìn)行批量測(cè)定，同時(shí)操作方便，減少了傳統(tǒng)紫外分光光度計(jì)比色皿清洗不徹底從而影響測(cè)定值的問(wèn)題。酶標(biāo)法的線性范圍良好，穩(wěn)定性、可重復(fù)性和精密度較高，測(cè)定時(shí)需要的樣品量少[10]。

1 儀器與試藥

酶標(biāo)儀(伯騰Epoch)；水浴鍋；天平；磁力攪拌器；容量瓶；離心管；蒽酮；98%濃硫酸；果糖；葡萄糖；蒸餾水。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 顯色劑的配制

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%、80%、85%、90%及98%的硫酸100 mL，加入0.2 mg蒽酮試劑，磁力攪拌器攪拌1 h，靜置30 min待使用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制

精密稱定果糖0.2 g，加水溶解并定容至 1 000 mL 的容量瓶，即得濃度為0.2 mg/mL果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密稱定葡萄糖0.2 g，加水溶解并定容至 1 000 mL 的容量瓶，即得濃度為0.2 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3 待測(cè)糖溶液的制備

將-80℃冷凍的番茄“16588”、“16698”、“16541”、“16513”去皮、籽，取3 g，加入80%乙醇20 mL，充分研磨成勻漿，沸水浴40 min ，過(guò)濾，加蒸餾水定容至25 mL。

2.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

為建立一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定果糖的含量的方法，對(duì)蒽酮硫酸比色法的測(cè)定波長(zhǎng)、水浴溫度、顯色劑用量、顯色時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.2.1 實(shí)驗(yàn)流程

取果糖標(biāo)準(zhǔn)液0 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、60 μL、80 μL到0～6號(hào)離心管中，加蒸餾水至100 μL，離心管置于冰水中，加顯色劑，震蕩混合、50℃水浴，立即冰水冷卻10 min，搖勻后以各自對(duì)照溶液調(diào)零，測(cè)定吸光值。

2.2.2 硫酸濃度選擇

果糖標(biāo)準(zhǔn)液0 μL、80 μL到離心管，加蒸餾水至100 μL，將各濃度蒽酮硫酸0.6 mL，震蕩混合、50℃水浴3 min，在500～800 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。結(jié)果顯示各顯色劑在630 nm波長(zhǎng)附近均有最大吸收峰，且硫酸含量為85%的顯色劑吸光值最大。故選擇85%的硫酸反應(yīng)試劑。

圖1 不同硫酸濃度Fig.1 Different sulfuric acid concentration

2.2.3 加樣方案選擇

取果糖標(biāo)準(zhǔn)液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液各0 μL、80 μL到離心管，加顯色劑0.6 mL，震蕩混合、50℃水浴3 min，在500～800 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。另一組果糖、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，離心管放入冰水中，再加顯色劑。結(jié)果(圖2)顯示：冰水中的葡萄糖較在室溫中的吸光值低，對(duì)果糖、葡萄糖混合液測(cè)定果糖含量影響可忽略不計(jì)，認(rèn)為該溫度條件下硫酸不與葡萄糖反應(yīng)，常溫中可能是由于硫酸溶于水瞬間放熱使得硫酸與部分葡萄糖發(fā)生反應(yīng)，從而使得吸光值升高。選擇冰水加樣為實(shí)驗(yàn)方案。

圖2 不同溫度Fig.2 Different temperature

2.2.4 最佳波長(zhǎng)

取果糖標(biāo)準(zhǔn)液操作同2.2.1實(shí)驗(yàn)條件同上，在500～800 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。由圖3可知：不同含量的葡萄糖溶液均在620 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故選擇620 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖3 不同波長(zhǎng)Fig.3 Different wavelength

2.2.5 顯色時(shí)間

取果糖標(biāo)準(zhǔn)液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液各80 μL到離心管，加蒸餾水至100 μL，50℃水浴0.5 min、1 min、1.5 min、2 min、2.5 min、3 min、3.5 min、4 min、4.5 min、5 min、7 min、10 min，操作同2.2.1以已得到的最佳條件進(jìn)行。由圖4可知：水浴3 min吸光值達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，故選擇3 min為最佳顯色時(shí)間。

圖4 不同水浴時(shí)間Fig.4 Different water bath time

2.2.6 顯色劑用量

果糖標(biāo)準(zhǔn)液操作同2.2.1已得到的最佳條件進(jìn)行。圖5可知：顯色劑在400 μL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2達(dá)到最佳值，故選擇400 μL為最佳顯色劑用量。

圖5 不同顯色劑含量Fig.5 Different dosage of chromogenic agent

2.2.7 穩(wěn)定曲線

取果糖標(biāo)準(zhǔn)液按最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，取出立即冰水冷卻10 min，搖勻后以對(duì)照溶液調(diào)零在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。圖6可知：最佳條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好(a)，可用于果糖含量的測(cè)定；在1 h內(nèi)測(cè)定果糖吸光值(b)較為穩(wěn)定，可用于批量測(cè)定。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(a)及穩(wěn)定曲線(b)Fig.6 The standard curve and the stability curve

2.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取果糖標(biāo)準(zhǔn)液按最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行。重復(fù)步驟3 次，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。三次測(cè)定相關(guān)系數(shù)R2分別為0.997 9、0.999 3、0.998 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.072%，表明優(yōu)選出的測(cè)定條件在所選的水平范圍內(nèi)為最佳條件，且方法穩(wěn)定，重復(fù)性好。

3 精密度試驗(yàn)

將不同濃度的果糖標(biāo)準(zhǔn)液(20 μL、40 μL、80 μL)，按2.2.8方法顯色，加到同一個(gè)酶標(biāo)板上測(cè)定吸光值，隨后分別加到3個(gè)不同的酶標(biāo)板上測(cè)量吸光值。同樣處理進(jìn)行2個(gè)批次，在620 nm處的吸光值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.2%～2.3%(表1)，表明儀器的精密性良好，可用于測(cè)定吸光值。

表1 精度測(cè)定值

4 番茄果糖含量的測(cè)定

4.1 番茄果實(shí)果糖含量測(cè)定

將所得糖液按照最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。按照公式

(C-在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的果糖含量，μg；Vs-提取液總體積，mL；Vt-測(cè)定時(shí)取用體積，mL；D稀釋倍數(shù)；W-樣品質(zhì)量，g)

得到“16698”果糖含量17.52mg/g，“16588”果糖含量16.01mg/g，“16541”果糖含量23.1mg/g，“16513”果糖含量22.41mg/g。

4.2 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的糖溶液各 5 份，分別精密加入果糖對(duì)照品2μg，按照2.2.8項(xiàng)方法分別測(cè)定其吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算回收率。結(jié)果(表2)表明測(cè)定結(jié)果可靠性良好，該方法可用于測(cè)定番茄總糖含量。

表2 回收率測(cè)定

5 討論

蒽酮硫酸比色法測(cè)定果糖的原理是利用糖類在較高溫度下可被濃硫酸脫水生成糠醛或羥甲基糖醛后，與蒽酮(C14H10O)脫水縮合，形成糠醛的衍生物，呈藍(lán)綠色，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與可溶性糖含量成線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)得到了蒽酮法測(cè)定果糖的硫酸濃度為85%、測(cè)定波長(zhǎng)620 nm、加樣方案為冰水加樣、顯色時(shí)間3 min、顯色劑用量400 μL、顯色 1 h內(nèi)吸光值較穩(wěn)定。

通過(guò)吸光值的大小及硫酸用量選擇了85%的硫酸，使得果糖充分脫水。根據(jù)報(bào)道葡萄糖與果糖共存時(shí)，水浴溫度在50℃時(shí)[11]，果糖與蒽酮顯色而葡萄糖不顯色，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：室溫時(shí)加入濃硫酸也會(huì)使得葡萄糖發(fā)生顯色反應(yīng)，而在冰水條件下加入濃硫酸葡萄糖顯色可以忽略不計(jì)，這種加樣方案可以更準(zhǔn)確的反應(yīng)混合物中果糖的含量，此操作方法與劉前[7]、張友杰[12]的不同。本實(shí)驗(yàn)選擇的測(cè)定波長(zhǎng)為620 nm，此波長(zhǎng)測(cè)定吸光值較好，也有研究者[7、12]選擇640 nm。顯色時(shí)間為3 min時(shí)，果糖與顯色劑充分反應(yīng)而葡萄糖不與之反應(yīng)，使測(cè)定混合物中果糖含量更為準(zhǔn)確。

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Establishment of a method for rapid determination of fructose content based on anthraquinone sulfate colorimetric method

REN Jing, LI Jing-fu, ZHANG Jia, LIU Jun-fang, XU Xiang-yang, JIANG Jing-bin

(Northeast Agricultural University, College of Horticulture and Landscape, Harbin 150036, China)

In this experiment, the content of fructose in tomato fruit was determined by anthrone colorimetry, and it was initially established that a miniaturization anthrone colorimetry used to determine the content of fructose and the optimum conditions for the determination of tomato fructose content via anthrone colorimetry. We did single factor experiments to four factors affecting the determination of the results: wavelength, dosage of chromogenic agent, chromogenic time and stable time. The results showed that the optimum conditions were as follows: 620nm wavelength, 85% sulfuric acid content, 400 μL chromogenic agent and 50℃ water bath for 3 min. Under the optimum conditions, the fructose content had a good linear relationship with the absorbance in the range of 2～16 μg. The fructose content of four tomato cultivars was determined by using the optimized method. The recoveries were between 102.32% and 107.38%. In this study, we obtained the optimal method for determination of tomato fruit fructose content which was a stable, highly effective and feasible method.

Tomato; Anthrone colorimetry; Miniaturization; Fructose

2017-04-02

番茄雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)與強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種創(chuàng)制(2016YFD0101703)

任婧(1992-)，女，碩士研究生。

李景富(1943-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，e-mail：Lijf_2005@126.com。

R927.2

A

1674-8646(2017)10-0082-04