張 可， 楊 帆， 孫艷玲， 劉振文， 王福生， 施 明

(北京大學(xué)解放軍三〇二醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院 a.感染性疾病診療與研究中心； b.肝移植研究中心， 北京 100039)

肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥的患者外周血濾泡殺傷性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)特點及臨床意義

張 可a， 楊 帆a， 孫艷玲b， 劉振文b， 王福生a， 施 明a

(北京大學(xué)解放軍三〇二醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院 a.感染性疾病診療與研究中心； b.肝移植研究中心， 北京 100039)

目的 研究肝移植患者外周血中濾泡殺傷性T淋巴細(xì)胞(Tfc)的表達(dá)特征及其在急性排斥反應(yīng)中的意義。方法 收集2015年12月-2017年2月解放軍第三〇二醫(yī)院肝移植研究中心接受肝移植患者36例，其中11例發(fā)生急性排斥反應(yīng)(AR組)，余下25例未發(fā)生排斥反應(yīng)(NAR組)，急性排斥反應(yīng)均由病理診斷確診。另選取體檢中心健康者20例作為對照(HC組)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測外周血中Tfc的特點，并分析其與總B淋巴細(xì)胞、幼稚B淋巴細(xì)胞和類別轉(zhuǎn)換記憶性B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞以及肝功能指標(biāo)之間的相關(guān)性。計量資料多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，進(jìn)一步兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。結(jié)果 3組之間患者外周血Tfc的頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意(H=32.18,P<0.001)，AR組患者外周血中Tfc的頻率明顯高于NAR組(U=60，P=0.008)和HC組(U=2，P<0.001)，NAR組Tfc的表達(dá)明顯高于HC組(U=40，P<0.001)。Tfc頻率與總B淋巴細(xì)胞、幼稚B淋巴細(xì)胞呈正相關(guān)(r值分別為0.665、0.462，P值均<0.001)；與類別轉(zhuǎn)換記憶性B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(r=-0.453，P=0.001)；與血清GGT水平呈正相關(guān)(r=0.371，P=0.026)。結(jié)論 肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)的患者外周血中Tfc頻率升高，且與B淋巴細(xì)胞以及肝臟膽管損傷存在一定的相關(guān)性，Tfc可能參與了肝移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)。

肝移植； 移植物排斥； T淋巴細(xì)胞

肝移植是治療終末期肝病的重要方法。肝臟不同于其他器官，是“免疫特惠”器官，即使陽性T淋巴細(xì)胞交叉配型也不會發(fā)生超急性排斥反應(yīng)[1]。但急性排斥反應(yīng)仍是肝移植失敗的重要原因之一[2]。已有的研究[3-6]表明，輔助性T淋巴細(xì)胞2、輔助性T淋巴細(xì)胞17、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、γδT淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等均參與了同種異體移植物的免疫反應(yīng)。最近的研究[7-11]發(fā)現(xiàn)CD4+CXCR5+濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞參與了小腸移植、腎移植、造血干細(xì)胞移植和肝移植后的免疫反應(yīng)。CD8+CXCR5+T淋巴細(xì)胞被命名為濾泡殺傷性T淋巴細(xì)胞(follicular cytotoxic T cells，Tfc)[12]，研究[13]表明其在某種程度上也可以支持淋巴器官中B淋巴細(xì)胞和IgG的產(chǎn)生。肝移植排斥患者肝臟組織中B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞表達(dá)增加，且在肝移植排斥早期，B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞的趨化因子表達(dá)亦增加[14]。但B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞以及Tfc在肝移植排斥中的作用，特別是在急性排斥反應(yīng)中的作用尚不清楚。本文對肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)患者外周血中Tfc和B淋巴細(xì)胞的頻率進(jìn)行研究，并結(jié)合臨床指標(biāo)，探討Tfc在肝移植急性排斥免疫反應(yīng)中可能發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2015年12月-2017年2月本院肝移植研究中心收治的肝移植術(shù)后患者36例，其中移植術(shù)后未發(fā)生急性排斥反應(yīng)者(NAR組)25例，術(shù)后1年內(nèi)患者一般情況良好，未出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)和原發(fā)病的復(fù)發(fā)，也未出現(xiàn)慢性排斥反應(yīng)及其他相關(guān)并發(fā)癥。NAR組中男19例，女6例，年齡32～66歲，平均(50.7±8.5)歲。移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)者(AR組)11例，其中男8例，女3例，年齡38～69歲，平均(49.2±10.2)歲。急性排斥反應(yīng)均由病理診斷確診。所有患者在移植術(shù)后早期采用“糖皮質(zhì)激素+鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(FK506)+嗎替麥考酚酯”三聯(lián)免疫抑制方案，術(shù)后3個月內(nèi)停用激素，3個月后根據(jù)患者情況，單獨使用FK506或聯(lián)合使用嗎替麥考酚酯。另選取20例本院體檢中心的健康人作為對照(HC組)，其中男16例，女4例，年齡36～60歲，平均(49.3±6.4)歲，肝功能及其他檢查結(jié)果均正常，既往無肝病史。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本處理 所有研究對象均于清晨空腹采集靜脈血7 ml，肝素鈉抗凝。用淋巴細(xì)胞分離液(天津美德太平洋有限責(zé)任公司)以密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，采用PBS洗滌2次并計數(shù)。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測外周血Tfc及B淋巴細(xì)胞 取新鮮分離的外周血單個核細(xì)胞100 μl (共1×106個細(xì)胞)，加入流式抗體CD3-BV510、CD8-Percp、CXCR5-Alexa Fluor 488、CD19-PE、IgD-Percp、CD27-APC，室溫避光孵育20 min，PBS洗滌后，加1%多聚甲醛固定，4 ℃保存，24 h內(nèi)使用FACS Verse流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 外周血Tfc及B淋巴細(xì)胞亞群的表達(dá)特點 CD8+T淋巴細(xì)胞中Tfc的頻率在3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=32.18，P<0.001)，其中肝移植術(shù)后患者外周血中Tfc頻率AR組高于NAR組(U=60，P=0.008)和HC組(U=2，P<0.001)，NAR組高于HC組(U=40，P<0.001)(圖1，2a)?？侭淋巴細(xì)胞(CD19+)和幼稚B淋巴細(xì)胞(CD19+IgD+CD27-)3組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(H值分別為14.21、23.46，P值分別為0.001、<0.001)，進(jìn)一步比較，總B淋巴細(xì)胞(CD19+)和幼稚B淋巴細(xì)胞(CD19+IgD+CD27-)頻率NAR組和AR組均高于HC組(U值分別為103、40、60、19，P值分別為0.001、0.004、<0.001、<0.001)(圖2b，c)。而類別轉(zhuǎn)換記憶性B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞(CD19+IgD-CD27+) 頻率3組間比較差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(H=25.24,P<0.001)，進(jìn)一步比較結(jié)果顯示HC組高于NAR和AR組(U值分別為54、17，P值均<0.001)(圖2d)。

圖1 3組外周血Tfc頻率流式圖

圖2 3組外周血Tfc、總B淋巴細(xì)胞、幼稚B淋巴細(xì)胞以及類別轉(zhuǎn)換記憶性B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞頻率比較

2.2 外周血Tfc與B淋巴細(xì)胞的相關(guān)性 外周血Tfc頻率與總B淋巴細(xì)胞和幼稚B淋巴細(xì)胞頻率均呈正相關(guān)(r值分別為0.665、0.462，P值均<0.001)(圖3a，b)；與類別轉(zhuǎn)換記憶性B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(r=-0.453，P=0.001)(圖3c)。

圖3 外周血中Tfc與總B淋巴細(xì)胞、幼稚B淋巴細(xì)胞、類別轉(zhuǎn)換記憶性B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的相關(guān)性分析

2.3 外周血Tfc與肝功能指標(biāo)之間的相關(guān)性 外周血中Tfc頻率與患者ALT和AST水平無明顯相關(guān)性，但與GGT水平呈正相關(guān)(r=0.371，P=0.026)(圖4)。

圖4 Tfc頻率與GGT水平的相關(guān)性

3 討論

本實驗初步研究了肝移植術(shù)后發(fā)生與未發(fā)生急性排斥患者以及健康對照者外周血Tfc和B淋巴細(xì)胞頻率的特征。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AR組患者Tfc的頻率明顯高于NAR組和NC組，提示Tfc可能參與了肝移植術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)。

CXCR5通常在CD8+T淋巴細(xì)胞上不表達(dá)，但當(dāng)CD8+T淋巴細(xì)胞需要遷移到濾泡B淋巴細(xì)胞區(qū)時，CXCR5的表達(dá)會上調(diào)。在HIV感染未治療患者體內(nèi)，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞通過高表達(dá)CXCR5進(jìn)入B淋巴細(xì)胞濾泡，并能清除病毒感染的濾泡性輔助性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，從而控制感染[12]。在淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)慢性感染的小鼠模型的淋巴組織中，大約30%的CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)CXCR5，且脾臟中Tfc的數(shù)量保持穩(wěn)定。Tfc比CD8+CXCR5-T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的抑制性受體如程序性細(xì)胞死亡蛋白1和T淋巴細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3少，表達(dá)的共刺激分子如殺傷性細(xì)胞凝集素樣受體G1多，且刺激后Tfc比CD8+CXCR5-T淋巴細(xì)胞亞群產(chǎn)生更多IFNγ和TNFα。因此，Tfc在LCMV慢性感染小鼠模型中，消耗較少且比CD8+CXCR5-T淋巴細(xì)胞具有更強的抗病毒功能[15]。Jiang等[16]發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體感染的小鼠模型中，Tfc還能表達(dá)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的分子標(biāo)志，如叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3、CD25和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體，而未表達(dá)殺傷性細(xì)胞的標(biāo)志物，如穿孔素。

Tfc在移植免疫中的功能研究尚未見報道，CD8+T淋巴細(xì)胞在移植排斥反應(yīng)中主要發(fā)揮輔助或殺傷性作用。在腎移植排斥患者的腎活組織檢查中也發(fā)現(xiàn)了大量CD8+T淋巴細(xì)胞的浸潤[17]。本研究發(fā)現(xiàn)Tfc在肝移植術(shù)后急性排斥患者的外周血中頻率增加，CD8+T淋巴細(xì)胞上CXCR5的表達(dá)會使CD8+T淋巴細(xì)胞遷移到濾泡B淋巴細(xì)胞區(qū)。CD4+CXCR5+T淋巴細(xì)胞可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的分化和漿細(xì)胞的產(chǎn)生[18]。Tfc在某種程度上也能夠支持扁桃體中B淋巴細(xì)胞和IgG的產(chǎn)生[13]。在原發(fā)性抗體缺乏癥患者中，CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞上CXCR5的表達(dá)均增加，可能與T淋巴細(xì)胞輔助B淋巴細(xì)胞分化產(chǎn)生免疫球蛋白有關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，Tfc與總B淋巴細(xì)胞、幼稚B淋巴細(xì)胞均呈明顯正相關(guān)，與類別轉(zhuǎn)換記憶性B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞呈明顯負(fù)相關(guān)。急性排斥患者外周血中類別轉(zhuǎn)換記憶性B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的頻率下降，可能與其遷移至移植肝臟中有關(guān)。Krukemeyer等[14]通過對肝移植排斥反應(yīng)的患者肝臟組織研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生排斥的患者比非排斥患者有更多的B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞遷移到移植肝臟中。還有研究[20]發(fā)現(xiàn)，移植后肝穿刺組織中有超過30%漿細(xì)胞浸潤的患者，發(fā)生了嚴(yán)重的排斥反應(yīng)；有超過10%漿細(xì)胞浸潤的，發(fā)生了中度或重度的排斥反應(yīng)。Tfc與患者的GGT水平呈明顯的正相關(guān)，提示可能與患者的膽管損傷有關(guān)。本實驗初步研究了Tfc在肝移植排斥患者外周血中頻率的變化，并推測了它與B淋巴細(xì)胞可能存在的關(guān)系，但Tfc在肝移植排斥反應(yīng)中表達(dá)受體和分泌細(xì)胞因子的功能的變化，以及如何對B淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步研究。

本研究首次初步探討了Tfc在肝移植急性排斥反應(yīng)中可能發(fā)揮的作用。但由于本研究樣本量有限，Tfc功能復(fù)雜，且肝移植急性排斥有多種免疫細(xì)胞的參與，過程復(fù)雜，因此，Tfc在肝移植免疫中的作用機制還有待進(jìn)一步探究。

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引證本文：ZHANK K, YANG F, SUN YL, et al. Characteristics and clinical significance of peripheral follicular cytotoxic T cells in patients experiencing acute rejection after liver transplantation[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(7): 1336-1339. (in Chinese) 張可， 楊帆， 孫艷玲， 等. 肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥的患者外周血濾泡殺傷性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)特點及臨床意義[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(7): 1336-1339.

(本文編輯：葛 俊)

Characteristics and clinical significance of peripheral follicular cytotoxic T cells in patients experiencing acute rejection after liver transplantation

ZHANKKe,YANGFan,SUNYanling,etal.

(TreatmentandResearchCenterforInfectiousDiseases, 302MilitaryHospitalofChina-PekingUniversityTeachingHospital,Beijing100039,China)

Objective To investigate the expression characteristics of peripheral follicular cytotoxic T (Tfc) cells in patients undergoing liver transplantation and their significance in acute rejection. Methods A total of 36 patients who underwent liver transplantation in Liver Transplantation Research Center in 302 Hospital of PLA from December 2015 to February 2017 were enrolled, and among these patients, 11 experienced acute rejection (AR group) and 25 did not experience acute rejection (NAR group). A confirmed diagnosis of acute rejection was made by pathological diagnosis. Another 20 healthy volunteers in Physical Examination Center were enrolled as controls (HC group). Flow cytometry was used to investigate the characteristics of Tfc in peripheral blood and its correlation with total B lymphocytes, juvenile B lymphocytes, memory B lymphocytes, plasma cells, and liver function parameters. The Kruskal-WallisHtest was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the Mann-WhitneyUtest was used for further comparison between any two groups; Spearman rank correlation was used for correlation analysis. Results The AR group had a significantly higher frequency of Tfc in peripheral blood than the NAR group (U=60,P=0.008) and the HC group (U=2,P<0.001), and the NAR group had a significantly higher frequency of Tfc than the HC group (U=40,P<0.001). The frequency of Tfc was positively correlated with total B lymphocytes and juvenile B lymphocytes (r=0.665 and 0.462, bothP<0.001), negatively correlated with memory B lymphocytes and plasma cells (r=-0.453,P=0.001), and positively correlated with serum gamma-glutamyl transpeptidase level (r=0.371,P=0.026). Conclusion There is an increase in the frequency of peripheral Tfc in patients who experience acute rejection after liver transplantation, which is correlated with B lymphocytes and hepatic bile duct injury. Tfc may be involved in acute rejection after liver transplantation.

liver transplantation; graft rejection; T-lymphocytes

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.07.027

2017-01-12；

2017-02-09。

國家自然科學(xué)基金(81571567)

張可(1991-)，女，主要從事肝病的基礎(chǔ)與臨床研究。

施明，電子信箱：shiming302@sina.com。

R617

A

1001-5256(2017)07-1336-04