王少揚, 林濤發(fā), 朱玲玲, 謝麗平

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院 感染科， 廈門大學附屬東方醫(yī)院 感染病學教研室， 福州 350003)

HBsAg和HBcAg聯(lián)合負載DC與CIK共培養(yǎng)細胞體系的建立和功能評估

王少揚, 林濤發(fā), 朱玲玲, 謝麗平

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院 感染科， 廈門大學附屬東方醫(yī)院 感染病學教研室， 福州 350003)

目的 觀察在不同HBV抗原負載下誘導的樹突狀細胞(DC)同細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)共培養(yǎng)后CIK的功能。方法 將2015年1月-2016年6月在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院就診的13例慢性乙型肝炎患者作為研究對象，分離13例慢性乙型肝炎患者的外周血單個核細胞，并培養(yǎng)DC和CIK，設為CIK單獨培養(yǎng)組、DC+CIK共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBcAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg+HBcAg共培養(yǎng)組，培養(yǎng)完成后，用ELISPOT方法測定CIK產生IFNγ的能力，用HepG2.2.15細胞作為靶細胞，測定CIK的殺傷功能。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。 結果 不同CIK試驗組產IFNγ的水平差異有統(tǒng)計學意義(F=29.84，P<0.001)，其中以DC+CIK+HBsAg+HBcAg組產生的IFNγ水平最高；CIK殺傷率組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=14.77，P<0.001)，其中以DC+CIK+HBsAg+HBcAg最為突出。結論 HBsAg和HBcAg聯(lián)合負載的DC與CIK共培養(yǎng)可能是治療慢性乙型肝炎有效的細胞體系。

肝炎， 乙型， 慢性； 肝炎表面抗原， 乙型； 肝炎核心抗原， 乙型； 樹突細胞； 殺傷細胞

近幾年樹突狀細胞(DC)聯(lián)合細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cell，CIK)在治療腫瘤方面的研究進展迅速，特別是在相關抗原負載下的DC與CIK混合培養(yǎng)達到了相互協(xié)同增強各自免疫功能的目的，共培養(yǎng)后回輸治療惡性腫瘤顯示出更加有效的臨床療效[1]?，F(xiàn)也有學者嘗試用不同的HBV抗原負載DC后再同自體CIK混合培養(yǎng)治療慢性乙型肝炎，初步顯示了一定的臨床療效，但用何種方式對DC負載培養(yǎng)兩者的協(xié)同效能最佳還存在不同的意見，有必要進一步探討。

1 資料和方法

1.1 研究對象 將2015年1月-2016年6月在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院感染科門診就診或住院的13例慢性乙型肝炎患者作為觀察對象，診斷標準符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010版)》[2]，并排除HCV、HIV等合并感染及酒精性肝炎、自身免疫性肝炎和其他因素造成的肝功能異常者。13例患者中男9例，女4例，平均(37.0±11.5)歲。本研究獲得所有患者的知情同意并通過醫(yī)院倫理委員會的審核。

1.2 DC的培養(yǎng) 無菌條件下，由專職人員使用血細胞分離機采集患者自體外周血單個核細胞 (PBMC)，細胞數(shù)量達到(1～3)×108以上，必須保證每位患者一套采集管道。收集的PBMC 重懸于無血清培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，去除非貼壁細胞(培養(yǎng)CIK用)，加入rhGM-CSF 1000 U/ml和rhIL-4 1000 U/ml，刺激細胞向DC分化；第3天半量換液，并加入rhGM-CSF 1000 U/ml和rhIL-4 1000 U/ml；在培養(yǎng)的第6天，分別加入HBsAg、HBcAg、HBsAg和HBcAg各1 μg/ml混合物，刺激抗原特異性的DC產生。

1.3 CIK的培養(yǎng)及鑒定 收集的PBMC重懸于無血清培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2條件下孵育2 h，收集非貼壁細胞，加入IFNγ 1000 U/ml培養(yǎng)，24 h 后加入CD3單克隆抗體1 μg/ml和rhIL-2 2000 U/ml，刺激CIK的生長和增殖；第3天進行一次傳代培養(yǎng)并補充rhIL-2 2000 U/ml；第7天收獲CIK，臺盼藍染色檢測細胞活力應在80%以上，用流式細胞儀檢測細胞免疫表型CD3、CD3+CD8+和CD3+CD56+等的表達。

1.4 DC和CIK共培養(yǎng)及鑒定 收集培養(yǎng)第7天的抗原負載的DC及CIK按1∶10 比例共培養(yǎng)，加入2000 U/ml rhIL-2，每3 d補充培養(yǎng)基及rhIL-2 2000 U/ml，第7天收集細胞，其數(shù)量應達到1×1010個以上，臺盼藍染色檢測細胞活力應在80%以上，同時采用流式細胞儀檢測細胞免疫表型CD3、CD3+CD8+和CD3+CD56+等的表達。

1.5 酶聯(lián)免疫斑點測定法檢測CIK產IFNγ的水平分別設立DC+CIK共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBcAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg+HBcAg共培養(yǎng)組，并設正對照孔(CIK+植物血凝素組)、負對照孔(CIK組)，每組設5個復孔，細胞接種于96孔板，終體積100 μl，按說明書逐步操作，并計算斑點數(shù)，記錄結果。

1.6 CIK的殺傷功能檢測 以HepG2.2.15細胞為靶細胞，效應細胞設立5組，分別為CIK單獨培養(yǎng)組、DC+CIK共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBcAg共培養(yǎng)組、DC+CIK+HBsAg+HBcAg共培養(yǎng)組；RPMI1640重懸效應細胞濃度為1×106/ml，靶細胞濃度為1×105/ml。將效應細胞和靶細胞按10∶1比例混合，培養(yǎng)于96孔板中，終體積200 μl，將細胞培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h。結果以DU 800分光光度儀，波長450 nm測量的吸光度(OD值)表示；殺傷率的計算：殺傷率=1-[(實驗組OD值-效應組OD值)/靶細胞組OD值]。

2 結果

2.1 不同CIK試驗組產IFNγ水平比較 多組間IFNγ水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。進一步兩兩比較，各組之間IFNγ水平差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.001)，其中DC+CIK+HBsAg+HBcAg組產生的IFNγ最多(表1)。

表1 不同CIK試驗組產生IFNγ的水平

2.2 不同試驗組CIK殺傷功能比較 CIK組、DC+CIK組、DC+CIK+HBsAg組、DC+CIK+HBcAg組、DC+CIK+HBsAg+HBcAg組的殺傷率依次分別為0.620±0.041、0.786±0.013、0.887±0.006、0.912±0.019、0.949±0.016，多組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=14.77，P<0.001)，進一步組間比較，差異也均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，其中DC+CIK+HBsAg+HBcAg組的殺傷率最高(圖1)。

圖1 不同分組CIK細胞殺傷功能的比較 *P=0.02, **P<0.001

3 討論

慢性乙型肝炎的治療主要是應用IFNα與核苷和核苷酸類藥物，前者因僅有部分患者應答，且具有明顯副作用，限制廣泛應用；后者具有明顯的抗病毒療效，但長期用藥易產生耐藥，且停藥后易復發(fā)，最為重要的是不能清除cccDNA，因此不能徹底清除病毒而達到治愈的目的，所以探討新的治療方法十分必要[2]。

目前DC和CIK治療是最有潛力的細胞免疫治療措施之一，有望能打破乙型肝炎患者的免疫耐受狀態(tài)而達到徹底清除病毒的目的。DC是已知的體內最強的抗原遞呈細胞，可以直接激活在體內的原始T淋巴細胞，這是誘導特異性免疫應答的關鍵環(huán)節(jié)[3]。研究證實慢性乙型肝炎患者存在DC功能的缺失，具體表現(xiàn)在細胞表面的共刺激分子CD80/CD86和人類白細胞抗原Ⅱ的表達減少，產生IL-12等細胞因子的能力、混合淋巴細胞反應能力降低，外周血單核細胞中產IFNγ的DC前體細胞的數(shù)量和功能也顯著下降，而通過體外相關抗原的誘導可恢復和改善DC功能，具有抑制HBV復制的效果[4-6]。CIK細胞是一群異質細胞群體，主要效應細胞是CD3+CD56+細胞，既具有T淋巴細胞的功能，又具有自然殺傷細胞的功能，并且不具有主要組織相容性抗原的限制，在體外可以大量擴增復制，具有明顯的臨床應用價值，經臨床觀察也具有一定的抗HBV的作用[7]。這兩類細胞已經在治療腫瘤方面做了大量的基礎和臨床研究工作[8]。而在慢性乙型肝炎治療方面，雖然已有許多探索性研究報道，但仍有許多問題有待解決。CIK所誘導的是非特異性免疫應答效應，雖然有一定的抑制HBV復制的療效，但療效多數(shù)是一過性的，不能長期維持，所以僅有部分患者產生臨床療效。DC可以誘導特異性免疫應答效應，并且維持持久的免疫應答能力，但是DC培養(yǎng)相對困難，并且細胞擴增的數(shù)量十分有限，難以達到臨床治療的需要。

在DC培養(yǎng)方面，如何給予抗原負載誘導也是決定DC功能恢復和增強的關鍵因素，現(xiàn)有多篇文獻報道HBsAg、HBcAg具有更強的免疫應答效果，如Shi等[9]利用HBcAg作為負載抗原較HBsAg所產生的DC會誘導更強的細胞毒性T淋巴細胞應答效應，且誘導共刺激分子的表達，如CD80、CD83、CD1a等明顯增強。Duan等[10]也做了類似的研究，以HBcAg負載的DC會誘導更強的特異性細胞毒性T淋巴細胞應答效應。筆者近期研究發(fā)現(xiàn)將HBsAg和HBcAg聯(lián)合負載DC所產生的免疫應答能力高于單獨抗原誘導。對DC和CIK混合培養(yǎng)，在腫瘤患者中研究發(fā)現(xiàn)，和單獨培養(yǎng)相比，無論DC功能的恢復還是CIK功能的改善均有明顯的提高，兩者混合培養(yǎng)有明顯的協(xié)同作用[11]。經本研究發(fā)現(xiàn)，同單獨CIK培養(yǎng)相比，DC和CIK混合培養(yǎng)后CIK功能明顯得到提高，產生IFNγ的能力明顯優(yōu)于CIK單獨培養(yǎng)，CIK殺傷功能檢測也發(fā)現(xiàn)混合培養(yǎng)的殺傷能力優(yōu)于CIK單獨培養(yǎng)，同時本研究發(fā)現(xiàn)HBsAg和HBcAg聯(lián)合負載DC與CIK混合培養(yǎng)是提高CIK免疫功能的較佳方案。

以上研究提示將HBsAg和HBcAg聯(lián)合負載DC與CIK混合培養(yǎng)后自體回輸可能是治療慢性乙型肝炎有效的措施，既具備特異性和持久的免疫應答效果，又具有廣泛的非特異性免疫應答能力。當然，體外細胞的功能并不能完全替代細胞回輸機體后的免疫功能表現(xiàn)，對臨床的療效還有待于進一步驗證。

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引證本文：WANG SY, LIN TF, ZHU LL, et al. Establishment and functional evaluation of DC-CIK co-culture system with combined loading of HBsAg and HBcAg[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(7): 1280-1283. (in Chinese) 王少揚, 林濤發(fā), 朱玲玲, 等. HBsAg和HBcAg聯(lián)合負載DC與CIK共培養(yǎng)細胞體系的建立和功能評估[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(7): 1280-1283.

(本文編輯：王亞南)

Establishment and functional evaluation of DC-CIK co-culture system with combined loading of HBsAg and HBcAgWANGShaoyang,LINTaofa,ZHULingling,etal.

(DepartmentofInfectiousDiseases,FuzhouGeneralHospitalofNanjingMilitaryAreaCommand,Fuzhou350003,China)

Objective To investigate the function of cytokine-induced killer cell (CIK) after co-culture of dendritic cells (DC) and CIK loaded with different HBV antigens. Methods A total of 13 patients with chronic hepatitis B (CHB) who visited Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Area Command from January 2015 to June 2016 were enrolled. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from 13 CHB patients, and DC and CIK were cultured and divided into CIK culture group, DC+CIK co-culture group, DC+CIK+HBsAg co-culture group, DC+CIK+HBcAg co-culture group, and DC+CIK+HBsAg+HBcAg co-culture group. Then ELISPOT assay was performed to measure the ability of CIK to produce pegylated interferonγ (IFNγ), and HepG2.2.15 cells were used as target cells to measure the killing function of CIK. A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous date between groups, and the least significant differencet-test was used for further comparison between any two groups. Results There was a significant difference in IFNγ level between different CIK test groups (F=29.84,P<0.001), and the DC+CIK+HBsAg+HBcAg group had the highest IFNγ level. There was a significant difference in CIK killing rate between groups (F=14.77,P<0.001), and the DC+CIK+HBsAg+HBcAg group had the highest CIK killing rate. Conclusion DC-CIK co-culture with combined loading of HBsAg and HBcAg may be an effective cell system for the treatment of CHB.

hepatitis B, chronic; hepatitis B surface antigen s; hepatitis B core antigens; dendritic cells; kill cells

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.07.015

2017-01-24；

2017-02-14。

福建省科技計劃項目重點項目(2013Y0073)

王少揚(1969-)，男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事病毒性肝炎防治的臨床和基礎研究。

R512.62

A

1001-5256(2017)07-1280-04