張 杰，劉 軍"

（1.周口師范學院生命科學與農學學院，河南周口466001；2.鄧州市成人教育教學研究室，河南鄧州474100）

植物和真菌雙重熒光染色方法研究

張 杰1，劉 軍2"

（1.周口師范學院生命科學與農學學院，河南周口466001；2.鄧州市成人教育教學研究室，河南鄧州474100）

雙重熒光染色便于觀察細胞的顯微結構，它具有精確、穩(wěn)定、可靠的優(yōu)勢.通過改進透化細胞壁和增加抗熒光淬滅劑的方法研究了植物細胞和真菌孢子的雙重熒光染色的方法.實驗結果表明：改進雙重熒光染色步驟后能夠使植物細胞和真菌孢子在熒光顯微鏡下顯示出清晰的雙重熒光.

雙重熒光染色；植物；真菌

隨著生物技術工作的不斷拓展和深入，雙重熒光染色法越來越受到生物學研究者的重視.雙重熒光染色方法有助于生物學工作者簡便、準確地了解研究對象［1］.由于兩種染料有不同的熒光光譜，可以在熒光顯微鏡下顯示不同的顏色，因此能夠更加準確、可靠地顯示出研究對象靜態(tài)或動態(tài)的變化［2］.雙重熒光染色法已廣泛用于觀察細胞發(fā)育、細胞凋亡、蛋白互作［3］.由于在實際應用中存在一些問題而受到一定限制，例如染色后內細胞團成云霧狀，導致無法準確分辨結構；染色后細胞內的亞顯微結構界限模糊，不能清晰地區(qū)分；試驗步驟繁瑣，所需時間較長等［4］.用雙重熒光染色的方法觀察植物細胞和真菌細胞內結構的研究尚未見報道，鑒于此，該試驗在前人試驗的基礎上，簡化雙重熒光染色的步驟，確定了適合植物和真菌的最佳染料濃度與處理時間，同時增加了抗熒光淬滅的雙重熒光染色方法，由此嘗試建立了一種針對植物和真菌的雙重熒光染色方法.

1 材料與方法

材料：洋蔥表皮細胞和綠僵菌孢子.

試劑：羅丹名標記actin抗體染色劑，核染色劑DAPI，PBS緩沖液pH 6.8.

改進方法：P______BS清洗細胞2次→0.5%曲拉通室溫透化細胞10min→5μg／mL的FITC－鬼筆環(huán)肽37oC染色60min→PBS清洗細胞2次→DAPI染色10min→PBS清洗細胞2次→滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上→蓋玻片封片→指甲油封邊→熒光顯微鏡觀察.

2 結果與分析

2.1 洋蔥表皮細胞染色結果

圖1 處理前洋蔥表皮細胞雙重熒光染色效果圖

由圖1可知，用未改進的方法處理洋蔥細胞后，在熒光顯微鏡下拍攝不到羅丹明標記的紅色actin（圖1B），而只拍攝DAPI標記的藍色細胞核的熒光信號（圖1C），細胞壁也呈現了藍色熒光，表明其專一性不強，進行整合后不能清晰顯示細胞核與actin結構關系圖（圖1D）.

圖2 處理后洋蔥表皮細胞雙重熒光染色效果圖

處理方法改進后，在熒光顯微鏡下拍攝得到兩種信號（圖2），紅色的羅丹明標記的actin（圖2 B），藍色為DAPI標記的細胞核（圖2C），然后進行整合，可以得到如圖2D所示的細胞核與actin結構關系.由圖2可知經過上述方法處理后，洋蔥表皮細胞的細胞壁和細胞核部位能夠被羅丹明標記的actin抗體染上清晰的紅色熒光；細胞核能夠被DAPI染上清晰的藍色；經過整合后，可以看到actin不僅作用于細胞核，而且在細胞壁部位也含有大量的actin.該結果表明經過上述方法處理后能夠使兩種染色劑穩(wěn)定地結合到目標部位.

2.2 真菌孢子染色結果

由圖3可知，用未改進的方法處理綠僵菌孢子后，在熒光顯微鏡下拍攝不到羅丹明標記的紅色actin（圖3B），而只拍攝到DAPI標記的藍色細胞核的熒光信號（圖3C），進行整合后不能清晰顯示細胞核與actin結構關系圖（圖3D）.

圖3 處理前綠僵菌孢子雙重熒光染色效果圖

圖4 處理后綠僵菌孢子雙重熒光染色效果圖

處理方法改進后，由圖4可知在熒光顯微鏡下拍攝得到兩種熒光信號，紅色的羅丹明標記的actin（圖4B），藍色為DAPI標記的細胞核（圖4C），然后進行整合，可以得到如圖4D所示的細胞核與actin結構關系.由圖4可知經過上述方法處理后，真菌孢子細胞質能夠被羅丹明標記的actin抗體染上清晰的紅色熒光；細胞核能夠被DAPI染上清晰的藍色；經過整合后，可以看到actin與細胞核部位重合，但是不能清晰地標記細胞壁部位.該結果表明經過上述方法處理后能夠使兩種染色劑穩(wěn)定地結合到真菌孢子的目標部位，但是不能清晰地標記真菌細胞壁.

3 討論

雙重熒光染色技術是細胞組織學研究最基本的技術，借助于染料與細胞特定的生化成分，使細胞內的不同組織呈現出不同的熒光顏色，以便觀察.通過雙重熒光染色分析能夠準確可靠地定位細胞核和actin的位置.羅丹明標記actin抗體染色時首先要通過0.5%曲拉通室溫透化細胞，否則該染料不能透過細胞膜導致染色失敗.曲拉通透化后能夠使羅丹明標記的actin抗體結合到actin上，actin能夠在熒光顯微鏡下顯示出清晰的紅色熒光，并且不影響下一步的復染結果（圖1和圖2）.該方法比通過水解細胞壁的方法縮短了染色時間［2，5］.與吖啶橙染色細胞核相比［6］，DAPI復染細胞核結果是結構更加清晰，易于觀察.DAPI染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的AT堿基區(qū)，用紫外光激發(fā)時發(fā)射出明亮的藍色熒光.DAPI染色并不影響植物細胞和真菌孢子細胞中actin的裝配（圖1和圖2）.在染色后封片時加上抗熒光淬滅劑能夠長時間地保持熒光而不淬滅.這樣更便于在顯微鏡下尋找理想的視野.

該實驗所用染色方法在植物細胞和真菌孢子中染色都能得到良好的效果，但是對真菌孢子染色時由于真菌孢子太小而不能清晰地區(qū)分出真菌孢子的細胞壁.故在該熒光染色方法的基礎之上，可以進一步地用細胞壁特異結合的熒光染料進行第三次染色進而觀察細胞壁的顯微結果.熒光染色方法雖然具有精確、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)點，但是實驗周期比較長、實驗試劑比較昂貴，而且對于實驗人員的技術要求較高［7］.通過改進操作方法和實驗流程能夠保持熒光染色方法的精確、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)勢，同時降低了對于實驗人員的技術要求，進而能夠使熒光染色方法在生物學研究領域普及推廣.

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S865.1

A

1671-9476（2017）02-0114-03

10.13450／j.cnkij.zknu.2017.02.028

2016-10-20；

2016-11-16

河南省教育廳自然科學資助項目（No.2011B180061）

張杰（1975－），男，河南太康人，講師，在讀博士，主要研究方向：分子生物學與生物工程.