趙錦慧，張 帆，郭 寧，張永亮，郭 婕

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001）

蛇床子醇提物對大腸桿菌的抑制作用研究

趙錦慧，張 帆，郭 寧，張永亮，郭 婕

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001）

以大腸桿菌為指示菌，OD值為測試指標(biāo)，通過大腸桿菌菌體密度－吸光值曲線及回歸方程的建立，獲得大腸桿菌最佳菌懸液稀釋度.利用濾紙片擴散法、倍比稀釋法分別測定不同濃度的蛇床子醇提物對大腸桿菌的抑菌圈大小、最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）.結(jié)果顯示：蛇床子醇提物對大腸桿菌的抑制作用明顯，250mg／mL和500mg／mL下的抑菌圈直徑分別為15.3mm和16.7mm，最低抑菌濃度（MIC）為250mg／mL，最小殺菌濃度（MBC）為500mg／mL.

蛇床子；醇提物；大腸桿菌；抑制作用

致病性大腸桿菌侵入人體一些部位時，可引起腹膜炎、膀胱炎、腹瀉等.家畜家禽感染致病性大腸桿菌不僅會影響其生長和發(fā)育，嚴(yán)重時可導(dǎo)致其死亡，前人對此做了許多相關(guān)研究［1－6］.許多中藥抑菌實驗研究［7－13］表明，中藥在現(xiàn)代預(yù)防和控制細(xì)菌性感染疾病方面發(fā)揮了積極作用.近年來，有關(guān)蛇床子單方或復(fù)方制劑對植物病原菌的抑制作用研究時有報道［14－16］，但關(guān)于蛇床子醇提物對致病性大腸桿菌的抑制作用研究鮮有報道，筆者對此進(jìn)行研究，旨在為中草藥蛇床子的開發(fā)利用提供一定的指導(dǎo).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌（Escherichia coil，ATCC11411），由周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院提供.

1.1.2 藥材

蛇床子，購于周口同和堂大藥店.

1.1.3 主要試劑

牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、1mol／L NaOH、1mol／L HCl、無水乙醇等.

1.1.4 主要試驗儀器

JD200-3電子天平（沈陽龍騰電子有限公司），HZQ-F250A高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海悅豐儀器儀表有限公司），THZ-82A氣浴恒溫振蕩箱（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠），XSP-24N顯微鏡（江南顯微鏡儀器廠），HH-S型水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠），LDZX-40KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），電子萬用爐（天津市中環(huán)路實驗電爐有限公司），DGF30電熱鼓風(fēng)干燥箱（南京實驗儀器廠），XB-K-25血球計數(shù)板（上海安信光學(xué)儀器制造有限公司），7230G分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）.

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

（1）牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基制備［17］

培養(yǎng)基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂10～20g、蒸餾水1 000mL.按培養(yǎng)基配方比例在電子天平上依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉放入燒杯中，在燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒攪勻，然后在鋪有石棉網(wǎng)的電爐上加熱使其溶解，再將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，不斷攪拌加熱溶化，最后補充水分到所需的體積.冷卻至常溫后用1mol／L NaOH或1 mol／L HCl調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2.

（2）液體培養(yǎng)基制備

配制方法同固體培養(yǎng)基（不加瓊脂）.

1.2.2 培養(yǎng)基及實驗用品滅菌

將上述配制好的培養(yǎng)基分裝在三角瓶中，將若干培養(yǎng)皿、試管、移液管、移液槍頭等用報紙包好，置于高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)，121℃，0.1MPa下滅菌20min.

1.2.3 大腸桿菌生長曲線測定

（1）菌種的活化培養(yǎng)［18］

用無菌接種環(huán)從試管斜面中挑取少許大腸桿菌菌種，接種于液體培養(yǎng)基中，搖床擴大培養(yǎng)24h（37℃，130r／min）.

（2）菌液的稀釋

用移液管吸取500μL已活化的菌懸液加入到裝有4.5mL無菌水的試管中，混合均勻，制成10－1的稀釋菌液，再從10－1的稀釋菌液中吸取500 μL加入到裝有4.5mL無菌水的試管中，制成10－2的稀釋菌液，依次類推，分別制成10－3，10－4，…，10－9的稀釋菌液.

（3）不同稀釋度菌懸液的吸光值測定

用分光光度計測定上述不同稀釋度菌懸液在波長為560nm處所對應(yīng)的吸光值A(chǔ).

（4）不同稀釋度菌懸液對應(yīng)的細(xì)菌個數(shù)測定用血球計數(shù)板計數(shù)，得出不同稀釋度菌懸液對應(yīng)的細(xì)菌個數(shù)（Xcfu／mL）.

（5）最佳菌懸液稀釋度的確定

根據(jù)以上所測定的A，X數(shù)值，繪制大腸桿菌A－X曲線并得出相應(yīng)的回歸方程，根據(jù)A－X曲線及回歸方程確定所需的最佳菌懸液稀釋度（大腸桿菌的菌體密度控制在102cfu／mL）.

1.2.4 蛇床子醇提物的制備［19］

將蛇床子粉碎，過40目篩，稱取粉末50g，加75%乙醇80℃下回流提取2次，每次2h，合并2次濾液，離心，取上清液，揮干溶劑后為醇提物.將醇提物用無水乙醇溶解，蒸餾水稀釋至含生藥500 mg／mL，乙醇終濃度為20%，調(diào)節(jié)pH為7.2，滅菌后4℃保存?zhèn)溆?

1.2.5 蛇床子醇提物對大腸桿菌生長的抑制作用指標(biāo)測定

（1）濾紙片擴散法測抑菌圈［20－21］

將中草藥蛇床子醇提物原液采用液體倍比稀釋法進(jìn)行稀釋，用無菌水稀釋后的藥液濃度分別為250，125，62.5，31.25，15.625mg／mL.

將配好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒3個平板，作無菌檢查.剪取直徑約為6mm的濾紙片，滅菌后放在不同濃度的藥液中浸泡約5h.在無菌工作臺中，無菌平板先涂布0.2mL的大腸桿菌菌懸液（菌體密度為102cfu／mL），然后用滅過菌的鑷子把浸泡過藥液的濾紙片夾到平皿上，一個平皿放3片，最后把平皿放在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察是否有明顯的抑菌圈，并測量其大小.

濾紙片擴散法可參考以下標(biāo)準(zhǔn)記錄結(jié)果：抑菌圈＜10mm，表示不敏感；10mm表示輕度敏感；11～15mm，表示中度敏感；16～20mm，表示高度敏感.

（2）最低抑菌濃度（MIC）測定［22］

將中草藥蛇床子醇提物原液采用液體倍比稀釋法進(jìn)行稀釋，用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋后的藥液濃度分別為250，125，62.5，31.25，15.625mg／mL.準(zhǔn)備7個試管，編號標(biāo)記，分別裝入藥液濃度為500，250，125，62.5，31.25，15.625，0mg／mL的藥液培養(yǎng)基，每管均為10mL.用滅菌的移液槍頭分別取1 mL具有合適菌體密度的菌懸液（菌體密度為102cfu／mL）加入到上述各試管中，混合均勻，將各試管放入搖床中培養(yǎng)（37℃，130r／min），24h后取出.在超凈工作臺上用無菌接種環(huán)將各管培養(yǎng)物取出，劃線于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，平板置溫度為37℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24h后取出觀察，以完全無菌生長的平板所對應(yīng)的提取液的最低濃度作為中草藥蛇床子醇提物的最低抑菌濃度（MIC）.

（3）最小殺菌濃度（MBC）測定［22］

在MIC測定的基礎(chǔ)上，從未見細(xì)菌生長的各平皿所對應(yīng)的試管培養(yǎng)物中各吸取0.1mL涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫條件下培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，以仍無細(xì)菌生長的管內(nèi)藥物濃度記為該藥的最小殺菌濃度（MBC）.設(shè)置3次重復(fù).

2 結(jié)果與分析

2.1 菌懸液的合適菌體密度的確定

對一系列稀釋度的大腸桿菌菌懸液在λ＝560 nm處測定其對應(yīng)的吸光值A(chǔ)，同時用血球計數(shù)板計數(shù)，得出一系列稀釋度的大腸桿菌菌懸液對應(yīng)細(xì)菌個數(shù)（Xcfu／mL）.對所得吸光值A(chǔ)和對應(yīng)的各稀釋度的大腸桿菌菌懸液菌體密度X進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，繪出各稀釋度的大腸桿菌菌懸液的A-X曲線，并得出相應(yīng)的回歸方程Y.見表1、表2、圖1.

表1 大腸桿菌菌懸液稀釋度與OD值的關(guān)系

圖1 大腸桿菌菌體密度與OD值的關(guān)系圖表2 大腸桿菌菌懸液稀釋度與菌體密度的關(guān)系

通過檢驗所測各稀釋度的大腸桿菌菌懸液A -X回歸曲線、回歸方程及A-X相關(guān)性顯著.由此得出結(jié)論：大腸桿菌在波長λ＝560nm處吸光值為0.4（對應(yīng)的菌懸液稀釋倍數(shù)是10－8）時能保證菌體密度為102cfu／mL.

2.2 蛇床子醇提物對大腸桿菌生長的抑制作用

2.2.1 對大腸桿菌的抑菌圈測定結(jié)果

表3 蛇床子醇提物對大腸桿菌的抑菌圈直徑

蛇床子醇提物對大腸桿菌的抑菌圈測定結(jié)果見表3.由表3可知，抑菌圈隨著蛇床子醇提物濃度的升高而增大，蛇床子醇提物濃度小于62.5mg／mL時，大腸桿菌對其表現(xiàn)不敏感；蛇床子醇提物濃度等于62.5mg／mL時，大腸桿菌對其表現(xiàn)出輕度敏感；蛇床子醇提物濃度等于125mg／mL時，大腸桿菌對其表現(xiàn)出中度敏感；蛇床子醇提物濃度大于250mg／mL時，大腸桿菌對其表現(xiàn)出高度敏感.這說明合適濃度的蛇床子醇提物對大腸桿菌具有抑制作用，濃度越高，抑制作用越強.

2.2.2 對大腸桿菌的最低抑菌濃度測定結(jié)果

表4 蛇床子醇提物對大腸桿菌的最低抑菌濃度

蛇床子醇提物對大腸桿菌的最低抑菌濃度測定結(jié)果見表4.由表4可知，中草藥蛇床子醇提物對大腸桿菌的抑菌程度隨藥液濃度的增大而增強，蛇床子醇提物濃度小于250mg／mL時，平板上仍有不同數(shù)量的大腸桿菌生長，蛇床子醇提物濃度≥250mg／mL時，平板上未見大腸桿菌生長，因此蛇床子醇提物對大腸桿菌的最低抑菌濃度為250 mg／mL.

2.2.3 對大腸桿菌的最小殺菌濃度測定結(jié)果

表5 蛇床子醇提物對大腸桿菌的最小殺菌濃度

蛇床子醇提物對大腸桿菌的最小殺菌濃度測定結(jié)果見表5.表5顯示，在MIC測定的基礎(chǔ)上重新涂布平板后，含有250mg／mL的蛇床子醇提物的平板上仍有少量的大腸桿菌生長，而500mg／mL的蛇床子醇提物的平板上未見到大腸桿菌，因此蛇床子醇提物對大腸桿菌的最小殺菌濃度為500mg／mL.

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

蛇床子醇提物對大腸桿菌有抑制作用，蛇床子醇提物濃度越高，對大腸桿菌的抑制程度越強，蛇床子醇提物濃度大于250mg／mL時，大腸桿菌對其表現(xiàn)出高度敏感.蛇床子醇提物對大腸桿菌的最低抑菌濃度為250mg／mL，最小殺菌濃度為500 mg／mL.

3.2 討論

在制備蛇床子醇提物時，用的是75%的乙醇，設(shè)定溫度為80℃，回流提取次數(shù)是2次，乙醇濃度、提取溫度及提取次數(shù)可能會影響蛇床子有效成分的溶出量，提取方法不同（比如水提法）也會影響蛇床子有效成分的溶出量，所以該試驗條件下得到的結(jié)果與前人［23］研究結(jié)果不一致.

由于較大的菌體密度會影響抑菌圈的產(chǎn)生，所以先要通過試驗得到最佳菌體密度.筆者通過不同稀釋度菌液吸光度的測定獲得了合適菌體密度的菌懸液，提高了試驗的準(zhǔn)確性.

中藥抑菌作用源自其有效成分或與其它藥物的協(xié)同作用，其作用強弱受藥物配伍的影響［24－25］.可進(jìn)一步將蛇床子與其它中草藥配伍，研究其對致病性大腸桿菌的抑制效果，為臨床試驗提供參考.

蛇床子醇提物中含有多種化學(xué)成分，究竟是哪些化學(xué)成分在抑制致病性大腸桿菌的過程中起到關(guān)鍵作用有待于進(jìn)一步探討.

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Study on inhibiting effect of alcohol extract from common cnidium fruit on Escherichia coli

ZHAO Jinhui，ZHANG Fan，GUO Ning，ZHANG Yongliang，GUO Jie
（College of Life Science and Agronomy，Zhoukou Normal University，Zhoukou 466001，China）

Selecting Escherichia coli as indicator bacteria and adopting OD value as test indicators，through microbial density of Escherichia coli and absorbance curve and regression equation to obtain the best bacterial suspension dilution of Escherichia coli.Inhibiting effect of different concentrations of alcohol extract from common cnidium fruit on Escherichia coli was studied by utilizing filter paper diffusion method and doubling dilution，testing index included inhibition zone size，minimum inhibitory concentration（MIC）and minimum bactericidal concentration（MBC）.The results showed that alcohol extract from common cnidium fruit had obvious inhibiting effect on Escherichia coli，inhibition zone size was 15.3mm and 16.7mm respectively under 250mg／mL and 500mg／mL of alcohol extract from common cnidium fruit，minimum inhibitory concentration（MIC）was 250mg／mL and minimum bactericidal concentration（MBC）was 500mg／mL.

common cnidium fruit；alcohol extract；Escherichia coli；inhibiting effect

R282.71

A

1671-9476（2017）02-0102-04

10.13450／j.cnkij.zknu.2017.02.025

2016-07-18；

2016-11-25

國家自然科學(xué)基金項目（No.41271280）；河南省高等學(xué)校重點科研項目（No.16B360007）

趙錦慧（1979－），女，河南周口人，碩士，講師，研究方向為生物技術(shù)及植物逆境生理.