周秀玲，楊延川，劉璐，張揚

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 聊城 252000)

豆豉來源的纖溶酶產(chǎn)生菌株的篩選及發(fā)酵性能研究

周秀玲，楊延川，劉璐，張揚*

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 聊城 252000)

采用酪蛋白平板初篩的方法，從豆豉中分離到278株具有蛋白酶活力的菌株，經(jīng)過纖維蛋白培養(yǎng)平板復(fù)篩，并獲得1株產(chǎn)纖溶酶能力較強的菌株，命名為LZ-238。在對LZ-238菌株常規(guī)形態(tài)學(xué)及生理生化特性鑒定的基礎(chǔ)上，對部分長度的16S rDNA同源性進行了分析，發(fā)現(xiàn)LZ-238菌株與地衣芽孢桿菌相似度達99.5%，命名為BacillusamyloliquefaciensLZ-238。通過液體發(fā)酵及阿膠納豆的制作，對LZ-238菌株產(chǎn)酶及應(yīng)用性能進行了評價。經(jīng)發(fā)酵，LZ-238菌株纖溶酶的最高產(chǎn)量可達28.12 U/mL，其制作的阿膠納豆具有豆豉的特有香氣且?guī)缀鯚o氨味，更符合中國人的口味。

豆豉；纖溶酶；篩選；菌株鑒定

豆豉作為我國的傳統(tǒng)食品一直受到大眾的青睞，無論是直接食用還是做菜調(diào)味都是餐中美味。豆豉在制作過程中經(jīng)微生物作用不僅營養(yǎng)價值得到提升，而且所產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)更是具有抗氧化、降血糖、降血壓、抗腫瘤、抗輻射等作用[1-3]，特別是其溶栓作用近年來越來越受到重視。我國研究者針對豆豉纖溶酶進行了大量的工作，包括菌株的篩選、纖溶酶基因的克隆表達、豆豉纖溶酶的純化及溶栓機制的研究等[4-13]。但是，現(xiàn)有的豆豉纖溶酶酶活力和生產(chǎn)水平直接制約著其進一步開發(fā)成保健食品和溶栓藥物。因此，通過高產(chǎn)菌株的篩選等方式提高酶活力及產(chǎn)量成為突破納豆激酶研究瓶頸的關(guān)鍵。

本研究以商品化和自制豆豉為出發(fā)材料，利用酪蛋白平板初篩及纖維蛋白培養(yǎng)平板高通量復(fù)篩的方法，篩選到一株豆豉纖溶酶高產(chǎn)菌株。通過生理生化特征分析結(jié)合16S rDNA序列分析確定其分類地位。通過液體發(fā)酵及阿膠納豆的制作，對其產(chǎn)酶及應(yīng)用性能進行了評價，為該菌的后續(xù)研究及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 豆豉

收集產(chǎn)地為重慶、長沙、陽江、南昌、武漢、北京、臨沂、聊城的商品化或自制的豆豉樣品若干份。

1.1.2 主要試劑

纖維蛋白原：購自Sigma公司；尿激酶和凝血酶：購自北京索萊寶科技有限公司。DNA提取試劑盒、PCR試劑及引物：購自上海生工生物工程有限公司。其他生化試劑為進口分裝或國產(chǎn)的分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：酪蛋白培養(yǎng)基，KH2PO40.5 g，KH2PO41 g，MgSO40.1 g，CaCl20.3 g，蔗糖1 g，酪蛋白2 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，水 1000 mL，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，大豆胨5 g，MgSO40.4 g，ZnSO40.1 g，KH2PO41 g，水1000 mL，pH 7.0～7.2。

保藏培養(yǎng)基：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂 15 g，水 1000 mL，pH 7.0～7.2。

纖維蛋白平板：參照Astrup等的方法進行制備[14]。將0.6 g 瓊脂加熱溶解于pH 8.5的20 mL巴比妥鈉-氯化鈉緩沖液中，待溫度降至 50 ℃左右時，加入含有20 mg纖維蛋白原的巴比妥鈉-氯化鈉緩沖液3 mL，混勻后再加入含有20 U凝血酶的巴比妥鈉-氯化鈉緩沖液3 mL，混勻后倒平板。

纖維蛋白培養(yǎng)平板：在纖維蛋白平板培養(yǎng)基中按酪蛋白培養(yǎng)基的比例加入KH2PO4，KH2PO4，MgSO4，CaCl2其他成分不變。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的初篩

在超凈工作臺中分別稱取豆豉樣品1.0 g，加入到盛有95 mL無菌水和玻璃珠的錐形瓶中，用6層無菌紗布封口。在37 ℃，180 r/min的條件下恒溫震蕩培養(yǎng)，6 h后置于85 ℃的水浴中靜置8 min，取1 mL上清液進行梯度稀釋。取各梯度稀釋液100 μL分別涂布于酪蛋白平板上，待風(fēng)干后倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中觀察菌落周圍是否有透明圈產(chǎn)生。選擇產(chǎn)生透明圈較大的菌落，用滅菌的牙簽接種到酪蛋白平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測量菌落直徑及其水解圈的直徑。通過計算水解圈直徑與菌落直徑的比，篩選比值較大的菌株進行保藏。

1.2.2 菌株復(fù)篩

將待篩菌株分別接種到種子培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)16 h后按照0.8%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)48 h后，將發(fā)酵液在4 ℃，12000 r/min條件下離心5 min，上清液即為粗酶液。測定粗酶液的纖溶酶活力，將酶活力較高的菌株保存于斜面，以進行后續(xù)實驗。改進方法：將初篩獲得的菌株用滅菌牙簽點種到纖維蛋白培養(yǎng)平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)32 h后測量菌落及水解圈的直徑，并以水解圈和菌落直徑之比判定菌株的纖溶酶活性。選擇比值大的菌株再按上述方法進行液體發(fā)酵培養(yǎng)后檢測纖溶酶活力。

1.2.3 纖溶酶活力測定

纖溶酶活力的測定參照文獻[15]的方法，略有改動，簡述如下：向滅過菌的10 mL離心管中加入50 mmol/L，pH 8.5的硼酸緩沖液4 mL，再加入0.72%的纖維蛋白原溶液0.4 mL，充分混勻后37 ℃水浴10 min，加入10 U/mL的凝血酶0.1 mL?；靹蚝?7 ℃水浴，待纖維蛋白原完全凝固成纖維蛋白后，加入0.1 mL稀釋的粗酶液，充分混勻后37 ℃水浴60 min，然后加入0.2 mol/L三氯乙酸2 mL以終止反應(yīng)。室溫下靜置20 min后，5000 r/min離心10 min，取上清液在275 nm波長下測量吸光度，記為Ar。空白對照組將三氯乙酸的加入放在加入酶液之前，其他操作過程不變，其上清液的吸光度記為Ac。1個單位的纖溶酶活性被定義為在60 min內(nèi)，使吸光度每增加0.001時所需要的酶量。

FU=(Ar-Ac)×稀釋倍數(shù)/0.001×60×0.1。

1.2.4 菌株的鑒定

1.2.4.1 生理生化特性檢測

參閱文獻[16,17]按一般細菌常用鑒定方法進行生理生化特性檢測。

1.2.4.2 16S rDNA分析

細菌總DNA的提取使用通用基因組小量抽提試劑盒進行提取。16S rRNA基因的擴增：利用通用引物27f 和1495r擴增16S rRNA 基因。PCR 50 μL反應(yīng)體系：5 μL 10×Taq 酶緩沖液、3 μL dNTP、5 μL引物、1 μL DNA模板、35 μL雙蒸水和1 μL Taq 酶。 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)數(shù)為35；72 ℃充分延伸10 min；4 ℃保存。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，目標片段由上海生物技術(shù)工程有限公司測序。測序結(jié)果登陸GenBank進行 BLAST比對。

1.2.5 菌株發(fā)酵性能檢測

1.2.5.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)

取1環(huán)菌種接種到種子培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h后按照1.2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，期間每隔4 h取樣2 mL，進行菌體生長情況及產(chǎn)酶量的檢測。

1.2.5.2 阿膠納豆的制作

參照文獻[18]的方法進行阿膠納豆的制作，制作完成后對其進行感官評價、纖溶酶活力、蛋白酶活力以及游離氨基酸總量的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 菌株初篩結(jié)果

利用稀釋涂布的方法從不同產(chǎn)地的豆豉中篩選到1286株具有酪蛋白分解能力的菌株，將其點種于酪蛋白平板上進行培養(yǎng)后獲得水解圈直徑與菌落直徑比較大的菌株278株，命名為LZ1～LZ278。不同菌株在篩選平板上形成的水解圈見圖1，圖1中a為產(chǎn)酶菌株在酪蛋白平板上形成的透明圈。

圖1 不同菌株在篩選平板上形成的水解圈

注：a為酪蛋白平板；b為纖維蛋白培養(yǎng)平板。

2.1.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

菌株復(fù)篩時發(fā)現(xiàn)如按照1.2.2的方法進行，雖然能對不同菌株的產(chǎn)酶能力進行有效檢測，但是檢測過程費時、費力而且效率較低。因此對復(fù)篩方法進行改進，將初篩獲得的菌株用滅菌牙簽點種到纖維蛋白培養(yǎng)平板上，培養(yǎng)后通過計算水解圈直徑與菌落直徑的比進行篩選。圖1中b為不同菌株在纖維蛋白培養(yǎng)平板上所形成的透明圈。為驗證改進方法的可行性，在278株菌中隨機挑選了30株，利用兩種方法進行篩選，結(jié)果見表1。

表1 兩種菌株復(fù)篩方法對隨機菌株的檢測Table 1 Detection of random strains by two screening methods

為了便于觀察，按照酶活力從小到大的順序在表中列出，由表1可知，對于產(chǎn)纖溶酶能力弱的菌株無法形成透明圈，隨著產(chǎn)酶能力的增加，直徑比值也呈現(xiàn)出增大的趨勢，雖然也有酶活力高直徑比相對低的情況發(fā)生，但該變化對酶活力和直徑比之間的關(guān)聯(lián)性并未影響。纖維蛋白培養(yǎng)平板的方法具有方便、快捷、高效的優(yōu)點，因此，可以選用此方法進行菌株復(fù)篩。

通過改進的復(fù)篩方法在278株菌株中篩選到3株菌的直徑比大于5.50，分別為LZ32，LZ209，LZ-238，其直徑比和纖溶酶活力分別為5.71，25.31 U/mL；5.58，25.26 U/mL；5.82，26.32 U/mL。選擇LZ-238進行后續(xù)研究。

2.2 LZ-238形態(tài)及生理生化特性

LZ-238在固體培養(yǎng)基上菌落細小，菌落直徑2～5 mm，多為圓形，凸起，表面光滑，邊緣整齊，呈灰白色。顯微鏡鏡檢為革蘭氏陽性菌，大小(2～5) μm×(0.4～0.6) μm，能產(chǎn)生橢圓形芽孢。對菌株LZ-238進行生理生化特征測定，結(jié)果見表2。參考伯杰氏鑒定手冊，可初步判定菌株LZ-238為芽孢桿菌屬微生物。

表2 LZ-238的主要生理生化特征Table 2 Main physiological and biochemical characteristics of LZ-238

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.3 LZ-238 16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

以LZ-238基因組DNA為模板，用細菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') PCR擴增16S rDNA單一條帶大約為1500 bp。將PCR產(chǎn)物送至上海生工公司進行測序。將所測序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，分析結(jié)果表明：與LZ-238同源性最高的前10株菌以枯草芽孢桿菌為主。應(yīng)用MEGA 6.0軟件中鄰接法(neighbour-joining methods，NJ)構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹，見圖2。

圖2 菌株LZ-238的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹

由圖2可知，菌株LZ-238與地衣芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)聚為一個分支上。結(jié)合形態(tài)、生理生化特征試驗及16S rDNA全序列分析的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果，可以將LZ-238的分類定位為B.amyloliquefaciensLZ-238。

2.4 LZ-238發(fā)酵性能

2.4.1 液體發(fā)酵性能

利用產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基對菌株LZ-238進行液體培養(yǎng)，其生長曲線及產(chǎn)酶進程見圖3。

圖3 地衣芽孢桿菌LZ-238的生長曲線和產(chǎn)酶曲線

由圖3可知，0～4 h為菌株的生長延滯期，4 h后菌株的增殖速度加快，進入生長對數(shù)期，培養(yǎng)28 h后菌株生長進入穩(wěn)定期，一直維持到36 h后進入衰亡期。對比產(chǎn)酶曲線可以發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)8 h后纖溶酶開始大量生成，16～24 h為發(fā)酵產(chǎn)酶的高峰期。發(fā)酵28 h后酶活水平趨于平穩(wěn)，在32 h檢測到酶活的最高值為28.12 U/mL，隨后酶活力呈現(xiàn)下降趨勢。由發(fā)酵結(jié)果可以看出LZ-238菌株的產(chǎn)酶過程穩(wěn)定，產(chǎn)酶量較高，如作為出發(fā)菌株，輔于工業(yè)誘變選育技術(shù)可望篩選獲得性能較好的生產(chǎn)菌株，具有較高的生成應(yīng)用價值。

2.4.2 阿膠納豆

以LZ-238為發(fā)酵菌株，參照文獻[18]的方法進行阿膠納豆的制作，同時與納豆芽孢桿菌進行對比。制作完成后對兩種納豆進行感官評價、纖溶酶活力、蛋白酶活力以及游離氨基酸總量的檢測。

表3 地衣芽孢桿菌LZ-238與納豆芽孢桿菌 發(fā)酵阿膠納豆的性能比較Table 3 Comparison of fermentation performance of B. licheniformis LZ-238 and B. natto

由表3可知，LZ-238作為阿膠納豆的發(fā)酵菌株具有優(yōu)良的性能，其發(fā)酵產(chǎn)物的纖溶酶活力、蛋白酶活力、以及游離氨基酸總量均比納豆芽孢桿菌高，其中纖溶酶活力更是高出2.34倍。更值得注意的是在感官評價上LZ-238菌株的評分也比納豆芽孢桿菌高，原因可能是其發(fā)酵的阿膠納豆具有豆豉的特有香氣且?guī)缀鯚o氨味，更符合中國人的口味。

3 結(jié)論

本研究采用酪蛋白平板初篩和纖維蛋白培養(yǎng)平板復(fù)篩的方法從眾多豆豉樣品中分離獲得一株纖溶酶的高產(chǎn)菌株LZ-238，經(jīng)生理生化特征分析結(jié)合16S rDNA序列分析，鑒定其為地衣芽孢桿菌。LZ-238的液體發(fā)酵研究表明菌株具有良好的發(fā)酵性能，在發(fā)酵32 h后檢測到最高酶活力為28.12 U/mL。在阿膠納豆的制作方面，其發(fā)酵產(chǎn)品在纖溶酶活力、蛋白酶活力和游離氨基酸含量方面均比納豆芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)品具有優(yōu)勢。由于菌株來源于中國傳統(tǒng)食品豆豉，其發(fā)酵的阿膠納豆幾乎沒有氨味且具有特殊的豆豉香氣，更容易被國人所接受。綜上所述，LZ-238菌株無論作為纖溶酶的生產(chǎn)菌株還是作為納豆的發(fā)酵菌株均具有優(yōu)良的性能，如能進一步研究開發(fā)將具有良好的應(yīng)用前景。

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Research on Screening and Fermentation Properties of Fibrinolysin Producing Strains from Fermented Soya Beans

ZHOU Xiu-ling, YANG Yan-chuan, LIU Lu, ZHANG Yang*

(College of Life Science, Liaocheng University,Liaocheng 252000,China)

Two hundred and seventy-eight strains of protease-producing strains are isolated from traditional Chinese fermented soybean food by using casein-plate method and one strain of highest fibrinolytic enzyme producing strains is screened by fibrin-plate method, which is named as LZ-238. Based on morphology, physiological and biochemical characteristics, LZ-238 is identified by 16S rDNA sequences and systematic analysis. The results indicate that 16S rDNA sequences of LZ-238 have 99.5% similarity to the partial sequence ofBacilluslicheniformis, suggesting that LZ-238 is categorized asB.licheniformis, and denominated asB.licheniformisLZ-238. The fermentation performance of LZ-238 under shaking and donkey-hide glue natto production is inspected preliminarily. Fibrinolytic enzyme activity ofB.licheniformisLZ-238 reaches 28.12 U/mL. The donkey-hide glue natto produced byB.licheniformisLZ-238 has less ammonia smell and is more in line with Chinese taste.

fermented soya beans;fibrinolysin;screening;strain identification

2017-02-16 *通訊作者

山東省自然科學(xué)基金(2014ZRB01A1N)；聊城大學(xué)博士科研啟動基金(31805)；聊城大學(xué)大學(xué)生科技文化創(chuàng)新基金(SF2014263)

周秀玲(1983-)，女，山東萊蕪人，碩士，研究方向：食品發(fā)酵； 張揚(1988-)，男，山東茌平人，博士，研究方向：食品發(fā)酵。

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.009

1000-9973(2017)07-0041-05