王嘉怡，宋艷，呂曉華*

(1.四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院，成都 610041；2.獸用功能性多肽制備國家地方聯(lián)合工程研究中心，成都 640066)

泡菜和酒渣中酵母菌的分離及其發(fā)酵作用初探

王嘉怡1，宋艷2，呂曉華1*

(1.四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院，成都 610041；2.獸用功能性多肽制備國家地方聯(lián)合工程研究中心，成都 640066)

目的：觀察從泡菜和酒渣中分離酵母菌發(fā)酵酒渣的效果。方法：從泡菜和酒渣中分離酵母菌，用其單獨和枯草芽孢桿菌先后發(fā)酵酒渣，檢測菌落總數(shù)、還原糖含量、纖維素酶活力和酒渣總蛋白含量。結(jié)果：從泡菜和酒渣中分離出的酵母菌在酒渣中正常生長，酒渣總蛋白含量增加；枯草芽孢桿菌和酵母菌先后發(fā)酵的酒渣總蛋白含量均高于對照組和酵母菌單獨發(fā)酵的酒渣總蛋白含量。結(jié)論：酒渣經(jīng)枯草芽孢桿菌和從泡菜和酒渣中分離出的酵母菌在適宜條件下發(fā)酵，單細(xì)胞蛋白含量升高，可望應(yīng)用于食品及飼料工業(yè)。

泡菜；酒渣；酵母菌；發(fā)酵；蛋白質(zhì)

單細(xì)胞蛋白(single cell protein, SCP)又稱微生物蛋白、菌體蛋白，1967 年第一屆世界單細(xì)胞蛋白會議上將其統(tǒng)稱為單細(xì)胞蛋白。SCP是利用各種基質(zhì)大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌、酵母菌、霉菌、微型藻等而獲得的微生物蛋白，它并非一種單純的蛋白質(zhì)，而是由蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、核酸、維生素和礦物質(zhì)等混合而成的細(xì)胞質(zhì)團(tuán)[1,2]。近年來，隨著農(nóng)副產(chǎn)品、工業(yè)加工廢物數(shù)量增長，給環(huán)境造成極大污染，SCP 又成為研究熱點，利用釀造業(yè)廢渣，如酒糟、醬油渣、啤酒渣、檸檬酸渣等來生產(chǎn)SCP既可減輕環(huán)境污染，又可得到食用蛋白質(zhì)和動物蛋白飼料，促進(jìn)資源的多元化利用，改善生態(tài)系統(tǒng)循環(huán)。

酵母菌(Yeast)是生產(chǎn)中常用的發(fā)酵菌種，其細(xì)胞中含有豐富的蛋白質(zhì)，是食品工業(yè)中重要的蛋白質(zhì)來源。目前常利用酵母菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉等微生物按比例混合發(fā)酵農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物，可降解廢棄物中難利用的物質(zhì)和提高營養(yǎng)物質(zhì)蛋白質(zhì)含量[3,4]。我國釀酒企業(yè)每年產(chǎn)生大量廢棄酒渣，酒渣主要由糧食作物組成并含有酯類、糖類等物質(zhì)，可作為酵母菌生長的營養(yǎng)基質(zhì)。然而黑曲霉代謝產(chǎn)生的赭曲霉毒素可能引發(fā)食品安全問題[5]。因此，文章從泡菜和酒渣中分離出安全的食品級酵母菌，以酒渣作為原料，探索其發(fā)酵酒渣的一般條件和改善酒渣品質(zhì)的程度，為提高食品加工副產(chǎn)品的附加值提供了新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及原料

Y1酵母菌(簡稱Y1)、Y2酵母菌(簡稱Y2)、B2枯草芽孢桿菌(簡稱B2)、B4枯草芽孢桿菌(簡稱B4) 四川金科藥業(yè)有限責(zé)任公司；散裝泡菜 市售；酒渣 四川水井坊股份有限公司。

1.1.2 主要儀器

SPX-250型生化培養(yǎng)箱 上海坤天實驗儀器有限公司；CJ-1S型超凈工作臺 天津市泰斯特儀器有限公司；UV2600型紫外可見分光光度計 上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌分離

散裝泡菜和酒渣取樣，富集培養(yǎng)，培養(yǎng)液梯度稀釋、涂布，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑疑似單菌落劃線分離至純凈。通過菌落形態(tài)學(xué)檢驗和細(xì)胞形態(tài)檢驗判定酵母菌，編號、保種。

1.2.2 菌種活化

將枯草芽孢桿菌接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，35 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，計菌落總數(shù)達(dá)到108cfu/mL。將酵母菌接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，計菌落總數(shù)達(dá)到108cfu/mL。

1.2.3 酒渣發(fā)酵

1.2.3.1 酒渣預(yù)處理

稱取50.00 g的酒渣于250 mL錐形瓶中，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，調(diào)水分含量為55%。

1.2.3.2 酵母菌發(fā)酵酒渣

將酵母菌菌懸液按10%的比例加入經(jīng)預(yù)處理的酒渣中，編號、均質(zhì)，28 ℃培養(yǎng)96 h，每12 h記錄酵母菌生長情況，發(fā)酵結(jié)束測菌落總數(shù)，50 ℃烘干至恒重，測總蛋白含量。

1.2.3.3 枯草芽孢桿菌和酵母菌先后發(fā)酵酒渣

將B2，B4的菌懸液按10%的比例加入經(jīng)預(yù)處理的酒渣中，編號(樣品+菌株編號)、均質(zhì)，35 ℃培養(yǎng)96 h，取樣測還原糖含量、纖維素酶活力以及含水量，見表1。

表1 酒渣經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后還原糖含量和纖維素酶活力Table 1 Reducing sugar content and cellulase activities of lees fermented by Bacillus subtilis

注：對照組為測定僅經(jīng)預(yù)處理的酒渣所得相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果。

繼續(xù)厭氧培養(yǎng)5天，調(diào)整含水量至55%，后按1.2.3.2操作。

1.2.4 菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2-2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》。

1.2.5 還原糖含量測定

參照GB/T 5009.7-2008 《食品中還原糖的測定》。

1.2.6 纖維素酶

參照NY/T 912-2004 《飼料添加劑 纖維素酶活力的測定 分光光度法》。

1.2.7 總蛋白含量測定

參照GB/T 6432-1994 《飼料中粗蛋白測定方法》。

2 結(jié)果

2.1 從泡菜和酒渣中分離出的酵母菌菌株形態(tài)特征

從泡菜和酒渣中各分離出一株酵母菌，分別編號為Y泡菜，Y酒渣。Y泡菜菌落直徑2～3 mm，表面呈顆粒狀無光澤，突起呈草帽狀，邊緣不規(guī)則，顏色呈乳白色不透明，質(zhì)地為膏狀，細(xì)胞呈卵圓形，見圖1和圖2。

圖1 Y泡菜菌落形態(tài)

圖2 Y泡菜細(xì)胞形態(tài)(×400倍)

Y酒渣菌落直徑3～5 mm，表面呈顆粒狀無光澤，突起呈低突起，邊緣為缺刻狀，顏色為乳白色不透明，質(zhì)地為膏狀，細(xì)胞呈橢圓形，見圖3和圖4。

圖3 Y酒渣菌落形態(tài)

圖4 Y酒渣細(xì)胞形態(tài)(×400倍)

2.2 從泡菜和酒渣中分離出的酵母菌對酒渣發(fā)酵的影響

2.2.1 酵母菌單獨發(fā)酵

2.2.1.1 酵母菌的生長狀況

發(fā)酵過程中，接種Y1的酒渣和接種Y2的酒渣未出現(xiàn)明顯變化。接種Y泡菜的酒渣在第48 h于酒渣表面形成菌落，并快速繁殖。接種Y酒渣的酒渣在第12 h于酒渣表面形成成片的菌落。發(fā)酵96 h時，接種Y1和Y2的酒渣中無活菌。Y泡菜和Y酒渣均可以在酒渣環(huán)境中正常生長繁殖，且Y酒渣的生長比Y泡菜旺盛。

酵母菌單獨發(fā)酵酒渣時酵母菌在酒渣中的生長情況見表2。

表2 酵母菌單獨發(fā)酵酒渣時酵母菌在酒渣中的生長情況Table 2 The growth condition of yeasts in lees fermented by the yeasts alone

注：“-”為無明顯現(xiàn)象，“+”為菌落形成，“++”為菌落形成增多。

酵母菌單獨發(fā)酵酒渣96 h時酵母菌菌落總數(shù)見表3。

表3 酵母菌單獨發(fā)酵酒渣96 h時酵母菌菌落總數(shù)Table 3 The total number of colonies in lees fermented by the yeasts alone after 96 h

2.2.1.2 酵母菌單獨發(fā)酵對酒渣總蛋白含量的影響

接種Y1和Y2的酒渣總蛋白含量均有提高，見圖5。

圖5 酵母菌單獨發(fā)酵96 h時酒渣中總蛋白含量

2.2.2 枯草桿菌和酵母菌先后發(fā)酵

2.2.2.1 酵母菌的生長狀況

表4 枯草桿菌和酵母菌先后發(fā)酵時酒渣中酵母菌的生長情況Table 4 The growth condition of yeasts in lees fermented byBacillus subtilis and Saccharomycetes

注：“-”為無明顯現(xiàn)象，“+”為菌落形成，“++”為菌落形成增多。

表5 兩菌先后發(fā)酵96 h后酒渣中酵母菌菌落總數(shù)Table 5 The total number of colonies in lees fermented byBacillus subtilis and Saccharomycetes after 96 h

由表4和表5可知，發(fā)酵過程中，先經(jīng)B2發(fā)酵后接種Y1和Y2的酒渣與先經(jīng)B4發(fā)酵后接種Y1的酒渣均無明顯變化。先經(jīng)B2發(fā)酵后接種Y泡菜和Y酒渣的酒渣與先經(jīng)B4發(fā)酵后接種Y泡菜和Y酒渣的酒渣均在第24 h于酒渣表面形成大片菌落。先經(jīng)B4發(fā)酵后接種Y2的酒渣在第48 h時于酒渣表面形成菌落。發(fā)酵96 h時，先經(jīng)B2發(fā)酵后接種Y1和Y2的酒渣與先經(jīng)B4發(fā)酵后接種Y1的酒渣中無酵母菌生長。Y泡菜，Y酒渣均能在先經(jīng)B2，B4分別發(fā)酵后的酒渣環(huán)境中正常生長繁殖，Y2能在先經(jīng)B4發(fā)酵后的酒渣中正常生長繁殖。

2.2.2.2 枯草桿菌和酵母菌先后發(fā)酵對酒渣總蛋白含量的影響

先經(jīng)B2發(fā)酵，后接種Y泡菜和Y酒渣的酒渣與先經(jīng)B4發(fā)酵，后接種Y泡菜和Y酒渣的酒渣總蛋白含量均高于空白組，同時也高于經(jīng)Y泡菜，Y酒渣單一發(fā)酵后的總蛋白含量。先經(jīng)B4發(fā)酵，后接種Y2的酒渣總蛋白含量在所有樣品中最高，見圖6。

圖6 兩菌先后發(fā)酵96 h時酒渣中總蛋白含量

3 討論

用于生產(chǎn)SCP 的微生物種類很多，包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌以及藻類等。在SCP 生產(chǎn)中選擇合適菌種的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該考慮如下原則[6]：對培養(yǎng)條件要求簡單；生長繁殖迅速；安全性和接受度：非致病性和無毒；容易回收；菌種具有遺傳穩(wěn)定性，以致有最優(yōu)生化和生理特性的菌株可能在成百上千代的處理中得以維持。酵母菌是人們生產(chǎn)生活中常用的發(fā)酵菌種，其細(xì)胞中含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類和維生素等物質(zhì)。20世紀(jì)80年代，酵母菌本身作為一種SCP，因其可以由各種基質(zhì)培養(yǎng)獲得開始被大量生產(chǎn)，成為食品工業(yè)重要蛋白質(zhì)來源。此外，枯草芽孢桿菌和黑曲霉也是發(fā)酵工業(yè)上常用的菌種，它們能產(chǎn)生多種酶類，具有很強的降解功能，但是黑曲霉在發(fā)酵過程中可能會產(chǎn)生一定量的赭曲霉毒素，而黑曲霉的孢子對人和動物的健康也有危害，因此需要對此類傳統(tǒng)工業(yè)的固態(tài)發(fā)酵方案做出改進(jìn)。我國每年廢棄的酒渣大約為4000萬噸，將廢棄酒渣利用起來，不僅可以減輕其給生態(tài)環(huán)境帶來的壓力，還可以提高副產(chǎn)品的附加值。

本文從泡菜和酒渣中分離出的兩株酵母菌可在酒渣環(huán)境中良好生長，并提高了酒渣的總蛋白含量；經(jīng)過枯草芽孢桿菌B2和B4預(yù)發(fā)酵后，酒渣的還原糖含量和纖維素酶活力均提高，可促進(jìn)酵母菌的生長繁殖。兩菌先后發(fā)酵的酒渣總蛋白含量在15.7%～16.9%，高于酵母菌單一發(fā)酵的總蛋白含量。這可能是因為在酵母菌單一發(fā)酵時，酵母菌只能利用酒渣中已有的糖類等營養(yǎng)因子；而在兩菌先后發(fā)酵時，枯草芽孢桿菌可代謝產(chǎn)出纖維素酶，有效將酒渣分解為可供酵母菌利用的糖類，加快了酵母菌的繁殖速率，延長了酵母菌生長繁殖的穩(wěn)定期，提高了酒渣的總蛋白含量。

近年來，已有研究用微生物固體發(fā)酵法發(fā)酵各類食品工業(yè)產(chǎn)生的廢料，如蘋果渣、番茄渣、夏橙皮渣等[7-10]，篩選適應(yīng)于該廢料環(huán)境并高產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的菌株。這類研究中，大多用黑曲霉作為發(fā)酵菌種，黑曲霉的安全隱患不容忽視。與同類研究相比，文章使用了酵母菌和枯草芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，降低了安全風(fēng)險。并且使用酒渣發(fā)酵時并未向其中加入其他的碳源、氮源等營養(yǎng)因子，降低了成本，僅通過微生物作用來提高酒渣的附加值，確有一定效果。在后續(xù)的研究中，還可對發(fā)酵的條件進(jìn)行探究，進(jìn)一步提高廢棄酒渣的價值，創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)效益。

[1]S R Chae，E J Hwang，H S Shin.Single cell protein production ofEuglenagracilisand carbon dioxide fixation in an innovative photo-bioreactor[J].Bioresource Technol,2006,97(2):322-329.

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[3]鄭立柱,杜敏娟,劉智峰.利用廢棄物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的資源化技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(13)：7697-7698.

[4]竇全林,楊明祿,周小玲.單細(xì)胞蛋白在食品和飼料中的生產(chǎn)利用現(xiàn)狀及前景[J].糧食與飼料工業(yè),2013(10)：38-42.

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Preliminary Study on Yeast's Isolation and Fermentation of Pickles and Lees

WANG Jia-yi1,SONG Yan2,LV Xiao-hua1*

(1.West China School of Public Health, Sichuan University,Chengdu 610041,China;2.National Union Engineering Research Center for the Preparation of Functional Polypeptides for Animals,Chengdu 640066,China)

Objective: To investigate the lees' fermentation effects by yeasts isolated from pickles and lees. Method: The yeasts are isolated from pickles and lees, and lees are fermented by yeasts alone and together withBacillussubtilis. The total number of colonies, reducing sugar content, cellulose activity and total protein content are determined in accordance with the corresponding national standards. Results: The yeasts isolated from pickles and lees grow normally in lees and the total protein content of lees increases. The total protein content of lees fermented byBacillussubtilisandSaccharomycetesisolated from pickles and lees is higher than that of the control group and the group of fermentation by yeasts alone. Conclusion: The lees could produce more single cell protein after fermented byBacillussubtilisand yeasts isolated from pickles and lees, which can be used in food and feed industries.

pickles；lees；yeast；fermentation；protein

2017-02-02 *通訊作者

王嘉怡(1993-)，女，四川成都人，碩士，研究方向：特殊人群營養(yǎng)； 呂曉華(1971-)，女，遼寧營口人，教授，博士后，研究方向：特殊人群營養(yǎng)。

TS255.5

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.006

1000-9973(2017)07-0025-04