彭銘燁，周夢(mèng)舟，付彩霞，李冬生，徐寧*

(1.湖北工業(yè)大學(xué)工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，武漢 430068；2.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

響應(yīng)面法優(yōu)化柑橘黃豆醬的制曲工藝

彭銘燁1，周夢(mèng)舟1，付彩霞2，李冬生1，徐寧1*

(1.湖北工業(yè)大學(xué)工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，武漢 430068；2.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

以優(yōu)化柑橘黃豆醬的制曲工藝為目標(biāo)，選取橘粉添加量、菌種復(fù)配比、制曲時(shí)間為影響因素，采用成曲中總黃酮含量為指標(biāo)進(jìn)行研究。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面法，建立回歸方程預(yù)測(cè)模型，得到最優(yōu)的制曲條件：橘粉添加量10%，菌種復(fù)配比3∶1，制曲時(shí)間44 h。該條件下測(cè)得成曲中總黃酮含量為0.4 mg RE/g，與理論值的相對(duì)誤差只有0.5%。

柑橘粉；米曲霉；黑曲霉；制曲；總黃酮

豆醬又稱大豆醬、豆醬，是指利用米曲霉等微生物發(fā)酵黃豆而制成的醬制品，是我國(guó)傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品[1]。

而制曲是黃豆醬制作的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，成曲的好壞會(huì)直接影響黃豆醬的品質(zhì)。在黃豆醬制曲過(guò)程中，諸多因素會(huì)對(duì)成曲的質(zhì)量造成影響，比如原料的配比、菌種的接種量、菌種的復(fù)配比以及制曲的時(shí)間等均會(huì)影響成曲的品質(zhì)。

柑橘是我國(guó)南方主要的水果之一，由于色、香、味兼?zhèn)?，爽口清香，甜爽多汁，風(fēng)味醇厚，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們喜愛(ài)[2]。但是柑橘生產(chǎn)加工過(guò)程中伴隨大約30%的皮等副產(chǎn)物的生成，大部分都被直接作為生活垃圾處理，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[3]。而柑橘皮中含有大量生物活性物質(zhì)，這些物質(zhì)不僅可以抗炎[4-7]，還可以降血脂[8,9]和調(diào)節(jié)新陳代謝[10-13]。因此，本研究根據(jù)影響醬油制曲的主要因素進(jìn)行試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以成曲中總黃酮的含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，得到柑橘曲料制備的最優(yōu)工藝，為制備高抗氧化活性的保健曲料提供理論性參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮柑橘皮 湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)集團(tuán)；大豆、面粉 市售；米曲霉AS 3.951(滬釀 3.042) 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心。

氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氯化鋁、甲醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘆丁(99%) 阿拉丁試劑(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJX-280HM菌培養(yǎng)箱 寧波萊福科技有限公司；WFJ2000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；YXQ-SG41-280-B高壓蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠；Biosafer-10D 臺(tái)式凍干機(jī) 賽飛(中國(guó))有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制備橘粉

將新鮮的柑橘皮于-18 ℃下冷凍48 h，然后將柑橘皮置于冷凍干燥機(jī)托盤上，冷凍干燥24 h，最后將干燥后的柑橘皮進(jìn)行粉碎并通過(guò)120目的網(wǎng)篩，得到橘粉。

1.3.2 工藝流程

橘粉 種曲(米曲霉和黑曲霉)

↓ ↓

黃豆 → 潤(rùn)水 → 蒸煮 → 冷卻 → 面粉→ 接種 → 制曲 → 成曲。

1.3.3 制曲

曲料配方：黃豆∶面粉為7∶3(m/m)，實(shí)驗(yàn)組采用橘粉替代部分面粉。黃豆經(jīng)浸泡后，121 ℃蒸壓20 min，冷卻后拌入面粉并接入種曲0.3% (m/m)，拌勻。制曲室34 ℃培養(yǎng)10～12 h，松曲1次。接著控溫32～35 ℃，19～22 h第2次松曲。最后調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度28～30 ℃，保持該溫度至制曲結(jié)束。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

選取橘粉添加量、菌種復(fù)配比和制曲時(shí)間3個(gè)因素，依據(jù)表1中的因素水平和試驗(yàn)條件采用1.3.3的方法制備曲料，然后檢測(cè)成曲中總黃酮的含量，考察以上因素對(duì)成曲中總黃酮含量的影響，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1 單因素試驗(yàn)條件Table 1 Factors and levels of single factor experiment

1.3.5 制曲工藝最優(yōu)參數(shù)的確定

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[14]，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其因素與水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface test

1.3.6 總黃酮的提取及含量測(cè)定

總黃酮的提取方法參考Xu等[15]的報(bào)道，稱取10 g冷凍干燥的成曲樣品，溶于100 mL 80% (V/V) 甲醇溶液中并于室溫下超聲15 min，10000 r/min離心10 min。殘余物繼續(xù)用上述方法提取，共提取3次，合并3次離心所得的上清液，該溶液用于測(cè)定總黃酮的含量。

總黃酮的含量測(cè)定方法參考黃健蓉等[16]的報(bào)道，即1 mL上清液用去離子水稀釋至5 mL，然后向溶液中加入0.3 mL 5% (m/V) NaNO2溶液。5 min后，加入0.3 mL 10% (m/V) Al(NO3)3溶液，放置6 min后，繼續(xù)添加2 mL 1 mol/L NaOH，然后用去離子水定容到10 mL。在510 nm條件下使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各個(gè)組分的吸光值，空白對(duì)照為未添加樣品的溶液和水混合體系。選取0，0.1，0.2，0.3,0.4，0.5, 0.6 mg/mL的蘆丁來(lái)繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傸S酮含量用蘆丁當(dāng)量RE/g表示，每個(gè)平行重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design Expert 8.0.5b，Excel 2013及SPSS軟件處理，差異顯著性水平P<0.05，平均數(shù)之間的比較采用極差檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 橘粉添加量對(duì)成曲中總黃酮含量的影響

圖1 橘粉添加量對(duì)成曲中總黃酮含量的影響

注：小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，空白表示只接種米曲霉制曲，下同。

據(jù)分析，柑橘皮中除了含有纖維素、木質(zhì)素以及豐富的微量元素外，還含有大量的黃酮類物質(zhì)，而黃酮類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性[17]。制曲中橘粉的加入不僅可以提高成曲的品質(zhì)，還可以增加其風(fēng)味和保健功效。Xu等研究發(fā)現(xiàn)市售醬制品中總黃酮的含量范圍在0.17～1.23 mg RE/g。

由圖1可知，在橘粉添加量為10%時(shí)，成曲中總黃酮的含量最高，可達(dá)到0.4 mg RE/g，與對(duì)照組相比提高了15%。但當(dāng)橘粉添加量為15%時(shí)，成曲中總黃酮比對(duì)照組降低了20%。由此可知，橘粉加入量過(guò)大會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，從而影響蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等各種酶的分泌，造成成曲中黃酮類物質(zhì)含量降低。故選定橘粉添加量為3%，7%和10%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 菌種復(fù)配比對(duì)成曲中總黃酮含量的影響

圖2 菌種復(fù)配比對(duì)成曲中總黃酮含量的影響

多菌種耦合制曲不僅可以彌補(bǔ)米曲霉單菌種制曲存在的酶系不足、成曲品質(zhì)一般、抗氧化活性物質(zhì)低等缺陷，還豐富了發(fā)酵的酶系，提高了成曲中總黃酮含量，對(duì)成曲品質(zhì)的提高有積極意義。

由圖2可知，當(dāng)米曲霉與黑曲霉的比例為2∶1接種制曲時(shí)，成曲中總黃酮的含量為0.26 mg RE/g，與對(duì)照組相比減少了24%。而隨著黑曲霉所占比例不斷降低，成曲中總黃酮的含量不降反增，在米曲霉與黑曲霉的比例為3∶1時(shí)可使成曲中總黃酮的含量達(dá)到最大。故選取菌種復(fù)配比為3∶1，4∶1和5∶1進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 制曲時(shí)間對(duì)成曲中總黃酮含量的影響

圖3 制曲時(shí)間對(duì)成曲中總黃酮含量的影響

在制曲過(guò)程中，菌種需要一定時(shí)間的萌發(fā)，從而才能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出孢子和菌絲，制曲時(shí)間過(guò)短，會(huì)導(dǎo)致菌絲生成不足，總黃酮含量較低，影響成曲的品質(zhì)；而制曲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)滋生更多的雜菌，導(dǎo)致成曲質(zhì)量降低。

由圖3可知，當(dāng)制曲時(shí)間為36 h時(shí)，成曲中總黃酮的含量為0.26 mg RE/g，與對(duì)照組相比減少了23%。而隨著制曲時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，成曲中總黃酮的含量也呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。在制曲時(shí)間為44 h時(shí)成曲中總黃酮的含量達(dá)到最大，其總黃酮的含量為0.4 mg RE/g。故選定制曲時(shí)間為40,44,48 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取橘粉添加量、菌種復(fù)配比、制曲時(shí)間3個(gè)因素為自變量，以成曲中總黃酮的含量為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface analysis

通過(guò) Design Expert 8.0.5b軟件中的Box-Benhnken Design模型對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸擬合，得到成曲中總黃酮的含量與3個(gè)因素之間的回歸方程：Y=0.36+0.014A-3.75×10-3B+7.5×10-3C-0.01AB+7.5×10-3AC+2.5×10-3BC+6×10-3A2+1×10-3B2-1.5×10-3C2，對(duì)模型進(jìn)行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸分析結(jié)果Table 4 Results of regression analysis

注：“*”表示差異顯著，P<0.05；“**”表示差異極顯著，P<0.01。

由表4回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)可知，該模型回歸顯著(P<0.05)，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，故響應(yīng)面方法對(duì)柑橘曲料的制備工藝的優(yōu)化合理可行。

根據(jù)表4中：F(A)=26.14，F(xiàn)(B)=1.94，F(xiàn)(C)=7.78可知，各因素條件對(duì)成曲品質(zhì)的影響程度大小順序?yàn)椋洪俜厶砑恿?制曲時(shí)間>菌種復(fù)配比。根據(jù)顯著性結(jié)果可知，回歸方程一次項(xiàng)A極顯著，一次項(xiàng)C和交叉項(xiàng)AB顯著，其他均不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果優(yōu)化與分析

根據(jù)Design Expert 8.0.5b軟件，做出各因素對(duì)成曲中總黃酮含量的響應(yīng)面分析圖，考察所擬合的響應(yīng)面形狀，分析橘粉添加量、菌種復(fù)配比、制曲時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響，其響應(yīng)面結(jié)果見(jiàn)圖4～圖6。

圖4 橘粉添加量和菌種復(fù)配比對(duì)成曲中總黃酮含量影響的響應(yīng)面圖

圖5 橘粉添加量和制曲時(shí)間對(duì)成曲中總黃酮含量影響的響應(yīng)面圖

圖6 菌種復(fù)配比和制曲時(shí)間對(duì)成曲中總黃酮含量影響的響應(yīng)面圖

依據(jù)Design Expert 8.0.5b軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化分析，得到最佳工藝條件：橘粉添加量為9.94%，菌種復(fù)配比為3.06∶1，制曲時(shí)間為44.6 h，總黃酮含量的理論值為0.402 mg RE/g?？紤]實(shí)際操作條件，將上述最佳發(fā)酵條件修正為：橘粉添加量10%，菌種復(fù)配比3∶1，制曲時(shí)間44 h。該條件下平行3次測(cè)得成曲中總黃酮含量為0.4 mg RE/g，相對(duì)誤差為0.5%，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況擬合較好。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法，結(jié)合Box-Benhnken Design模型的分析，對(duì)柑橘黃豆醬制曲工藝進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)一步得到最優(yōu)的工藝條件：橘粉添加量為10%，菌種復(fù)配比為3∶1，制曲時(shí)間為44 h。該條件下測(cè)得成曲中總黃酮含量為0.4 mg RE/g，相對(duì)誤差為0.5%。利用柑橘皮制備黃豆醬的曲料，該曲料不僅具有顯著的柑橘風(fēng)味，還可以提高曲料中總黃酮的含量，使該曲料的品質(zhì)得到提升，同時(shí)增加黃豆醬的保健功效和提高柑橘皮的附加值。

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Optimization of Koji-making Process of Citrus Soybean Paste by Response Surface Methodology

PENG Ming-ye1, ZHOU Meng-zhou1, FU Cai-xia2, LI Dong-sheng1, XU Ning1*

(1.Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation,Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei Province,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China；2.Hubei Tulaohan Flavouring and Food Co.,Ltd., Yichang 443000, China)

The objectives of this study are to optimize the koji-making process of citrus soybean paste with combination of one-factor-at-a-time method(OFAT) and response surface methodology(RSM)．The influence factors are additive amount of citrus powder, strain multiplexing ratio and koji-making time.The index is the content of total flavonoids in finished koji. The single factor experiment is used to set up the simulated quadratic polynomial regression equation of prediction model about influence factors and index value by using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis theory. The results show that the optimum koji-making conditions are as follows: the additive amount of citrus powder is 10%, the ratio ofAspergillusoryzaeandAspergillusnigeris 3 and the koji-making time is 44 h. Under such conditions，the content of total flavonoids is 0.4 mg RE/g in finished koji, and the relative error with theoretical value is only 0.5%.

citrus powder；Aspergillusoryzae；Aspergillusniger；koji making；total flavonoids

2017-02-10 *通訊作者

湖北省自然基金(2015CFB679)；湖北省科技廳項(xiàng)目(2015BCE028)

彭銘燁(1992-)，男，江西宜春人，碩士，研究方向：食品科學(xué)； 徐寧(1979-)，男，陜西渭南人，副教授，博士，研究方向：發(fā)酵食品。

TS264.24

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.07.002

1000-9973(2017)07-0006-05