李釗政 萬雷 喬榮勤 彭鵬豪 肖本浩 劉少津

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510240

骨質(zhì)疏松癥是困擾老年人身體健康的一大疾病，亦是世界性前沿研究難題。Wnt信號通路是與骨代謝相關(guān)的一個(gè)重要胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，DKK1和Sost是Wnt信號通路的負(fù)調(diào)控因子，在骨形成過程中起重要作用，被視為骨相關(guān)疾病如骨質(zhì)疏松、骨修復(fù)的治療靶點(diǎn)[1]。近年來，有研究表明雌激素受體相關(guān)受體α(estrogen receptor-related receptor alpha，ERRα)與骨代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[2]。Auld 等[3]發(fā)現(xiàn)，ERRα通過抑制Wnt信號靶基因表達(dá)來調(diào)控成骨細(xì)胞分化，當(dāng)成骨細(xì)胞中ERRα基因沉默后，可促進(jìn)Wnt通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。而XCT-790是ERRα的特異性抑制劑[4]，可以顯著降低成骨細(xì)胞的增殖能力和礦化能力[5]。本實(shí)驗(yàn)采用沉默DKK1、Sost腺病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，并用ERRα抑制劑(XCT-790)干預(yù)轉(zhuǎn)染的MG63細(xì)胞，應(yīng)用Western blot檢測MG63細(xì)胞中骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)、成纖維生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)蛋白的表達(dá)量，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人成骨肉瘤細(xì)胞(MG63) 由中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫提供，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Pen/Strep和Opti-MEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；ERRα抑制劑(XCT-790)購自于Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2000，TRIzol Reagent、Taq DNA聚合酶、熒光定量PCR試劑盒均購自美國Invitrogen 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收/純化試劑盒購自北京天根生物有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京鼎國生物有限公司；BJ5183感受態(tài)細(xì)胞購自上海杰美基因公司；T4DNA連接酶、KpnⅠ、XhoⅠ、PmeⅠ、PacⅠ限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；抗Wnt信號通路抑制因子DKK1抗體購自美國CST公司；抗骨硬化蛋白(Sost) 抗體購自美國Abcam公司；抗結(jié)締組織生長因子(CTGF)抗體、抗堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF2)抗體購自美國Santa公司；抗人成骨細(xì)胞內(nèi)骨保護(hù)素(OPG)抗體、抗腫瘤壞死因子α(TNFα)抗體購自美國abcam公司；蛋白Marker購自美國Fermentasa 公司；蛋白酶抑制劑/磷酸化抑制劑、ECL發(fā)光液購自德國Merck公司；RIPA 細(xì)胞裂解液、Triton 100、EGTA、MTT 購自美國Sigma 公司；Calcium OtangeTM Indicators 購自美國Molcular Probes公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱(DHP-9052，中國上海一恒)、超凈工作臺(SWCJ-1FD，中國江蘇蘇凈)、高速低溫離心機(jī)(H1650-W/H1650W，中國湘儀)、普通PCR儀(TC-S，中國博日)、熒光定量PCR儀(ABI7500，美國Thermo)、倒置熒光顯微鏡(IX73，美國OLYMPUS)。電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra，美國Bio-Rad)、蛋白轉(zhuǎn)印儀(Mini Trans-Blot，美國Bio-Rad)、凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc MP，美國Bio-Rad)，微量核酸定量儀(Nanodrop-2000，美國Thermo)。

1.2 方法

1.2.1MG63細(xì)胞培養(yǎng)：收集對數(shù)期MG63細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/mL。6孔板中每孔加入2 mL細(xì)胞懸液，置于37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，用沉默重組腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞(MOI=50)。

1.2.2目的基因沉默重組腺病毒載體的構(gòu)建[6]：在NCBI數(shù)據(jù)庫查詢參考核苷酸序列DKK1(801bp)、Sost(642bp)，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR引物，設(shè)計(jì)出特異性針對DKK1、Sost 的序列和無關(guān)對照序列(Scr)，并在兩端分別加入AgeⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的DH5α細(xì)胞，用質(zhì)粒小提試劑盒提取轉(zhuǎn)化到DH5α細(xì)胞重組質(zhì)粒，對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，提取測序正確的腺病毒，經(jīng)培養(yǎng)提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒，再經(jīng)過篩選及病毒包裝，成功構(gòu)建沉默DKK1、Sost腺病毒載體。

1.2.3XCT-790處理沉默DKK1、Sost腺病毒載體轉(zhuǎn)染的MG63細(xì)胞：100 μM XCT-790溶于838 μL DMSO中配制成儲(chǔ)存液。臨用時(shí)，以XCT-790儲(chǔ)存液：含10%FBS DMEM高糖培養(yǎng)基=1∶1 000的比例稀釋XCT-790，即配制成含100 μM XCT-790的DMEM高糖培養(yǎng)基(DMSO終濃度為0.1%)，分別處理空載腺病毒組和DKK1、Sost沉默腺病毒載體轉(zhuǎn)染組，培養(yǎng)24 h。

1.2.4細(xì)胞總蛋白的提取及濃度測定：消化收集細(xì)胞，1000 rpm離心5 min，盡可能棄盡上清。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞沉淀兩次，向細(xì)胞沉淀中加入20 μL RIPA(含有0.2 μL PMSF)裂解液，置于冰上裂解細(xì)胞30 min，期間用槍頭吹打使細(xì)胞充分裂解。在4 ℃，12 000 rpm離心30 min，小心轉(zhuǎn)移上清到新的預(yù)冷的EP管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?00 μL Bradford加入1 μL待測蛋白和99 μL 0.9%生理鹽水，混勻后在595 nm處檢測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出各樣本蛋白濃度。

1.2.5OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白的檢測：MG63細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組腺病毒48 h后，分為空白對照組、沉默DKK1組、沉默Sost組、沉默DKK1、Sost組、XCT-790處理空載腺病毒組、XCT-790處理沉默DKK1組、XCT-790處理沉默Sost組、XCT-790處理沉默DKK1、Sost組8組，棄舊培養(yǎng)基，消化收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光顯色后進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組的MG63細(xì)胞中(OPG、CTGF、FGF2、TNFα)蛋白灰度分析(圖1)

圖1 各組MG63細(xì)胞中(OPG、CTGF、FGF2、TNFα)灰度分析情況(凝膠電泳法)Fig.1 Analysis of gray area of OPG, CTGF, FGF2, and TNFα in each MG63 cell group (The gel electrophoresis)注：1：空白對照組，2：沉默DKK1組，3：沉默Sost組，4：沉默(DKK1+Sost)組，5：XCT-790處理空載腺病毒組，6：XCT-790處理沉默DKK1組，7：XCT-790處理沉默Sost組，8：XCT-790處理沉默(DKK1+Sost)組。

2.2 各組MG63細(xì)胞中(OPG、CTGF、FGF2、TNFα)蛋白表達(dá)情況(表1)

表1 各組MG63細(xì)胞中(OPG、CTGF、FGF2、TNFα)蛋白表達(dá)情況Table 1 Expression of OPG, CTGF, FGF2, TNFα in each MG63 cell group

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與沉默DKK1組比較，#P<0.05；與沉默Sost組比較，△P<0.05；與沉默(DKK1+Sost)組比較，▲P<0.05。

圖1、表1結(jié)果顯示：(1)與空白對照組對比，沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost可以提高OPG、CTGF、FGF2表達(dá)量(P<0.05)，降低TNFα表達(dá)量，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；XCT-790干預(yù)MG63細(xì)胞可降低OPG、CTGF、FGF2表達(dá)量(P<0.05)，增加TNFα表達(dá)量，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(2)與沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost組相比較，XCT-790處理沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost組可降低因沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost而增加的OPG、CTGF、FGF2表達(dá)量，增加因沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost而降低的TNFα表達(dá)量，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

近年來，國內(nèi)外不少研究表明Wnt/β-catenin信號通路在骨代謝過程中具有重要意義，是研究骨質(zhì)疏松癥治療的新熱點(diǎn)。其組成主要包括細(xì)胞外因子(Wnt)、跨膜受體(frizzled)、胞質(zhì)蛋白(β-catenin)及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子等一系列蛋白。Wnt信號刺激成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Osterix1(Osx1)向成骨細(xì)胞表達(dá)[7]。DKK1和Sost蛋白為Wnt信號通路的細(xì)胞外拮抗劑，與骨形成的調(diào)控密切相關(guān)。DKK1直接與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein re-ceptor related protein，LRP)受體結(jié)合，或者與其跨膜受體Kremen(Kremen-1、Kremen-2) 結(jié)合后再與LRP5/6結(jié)合形成三聚體，誘導(dǎo)快速的細(xì)胞內(nèi)吞，減少細(xì)胞膜上的LRP5/6，由此阻斷了Wnt信號向胞內(nèi)的傳遞，使骨形成減少[8]。Sost 能競爭性結(jié)合Wnt信號通路中的共受體LRP5來抑制該信號通路，從而引起骨形成障礙[9]。雌激素受體相關(guān)受體α(ERRα)是最早發(fā)現(xiàn)的一種孤兒核受體，是核受體超家族中的一員。有研究表明，ERRα表達(dá)于成骨細(xì)胞分化的所有階段，用反義寡核苷酸阻斷ERRα降低了大鼠RC細(xì)胞增殖期的細(xì)胞數(shù)目，之后又抑制了骨結(jié)節(jié)形成[10]。然而，Delhon 等[11]發(fā)現(xiàn)，ERRα敲除小鼠股骨松質(zhì)骨骨體積和密度增加，體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞沉默ERRα后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖與骨向分化能力增強(qiáng)。OPG屬分泌型糖蛋白，是一種可溶性腫瘤壞死因子受體，在體內(nèi)以單體和同源二聚體兩種形式存在。其主要功能是抑制破骨細(xì)胞的分化，抑制成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性并誘導(dǎo)其凋亡。在體外，1～40 ng/mL(ED50=4～6 ng)的OPG可抑制破骨細(xì)胞生成，在超過11 d的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間中，有效作用時(shí)間范圍是第5～11 d[12]。CTGF是一種新發(fā)現(xiàn)可刺激成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積生長因子，亦是高度保守CCN(CTGF、Cef10/cyr61和Nov縮寫)多肽家族中成員。有研究表明，CTGF可抑制成骨細(xì)胞核因子Kappa B配體受體(RANKL)的表達(dá)，提示CTGF可通過抑制成骨細(xì)胞RANKL的表達(dá)，可能具有間接抑制成熟破骨細(xì)胞活化的作用[13]。FGF2是膜內(nèi)成骨和軟骨化成骨的主要調(diào)節(jié)因子，在成骨細(xì)胞中，F(xiàn)GF2激活多種信號通路包括胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑和蛋白激酶C(PKC)途徑，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，被認(rèn)為是成骨樣細(xì)胞的靶基因[14]。TNFα是17kDa的細(xì)胞因子，可由破骨細(xì)胞樣細(xì)胞及成骨細(xì)胞合成，是十分重要的破骨細(xì)胞激活因子，亦是一種強(qiáng)有力的骨吸收誘導(dǎo)劑，可使破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)。有報(bào)道表明，基質(zhì)內(nèi)所含的破骨和成骨類細(xì)胞以及髓腔間充質(zhì)類細(xì)胞均可以通過自分泌或者旁分泌方式獲得細(xì)胞因子，并參與機(jī)體骨代謝調(diào)節(jié)[15-16]。由此可知，OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白的表達(dá)量與成骨細(xì)胞的增殖分化關(guān)系密切。

本實(shí)驗(yàn)研究中采用沉默DKK1、Sost腺病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞，并使用XCT-790干預(yù)，進(jìn)一步研究不同組別MG63細(xì)胞中OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白在不同干預(yù)情況下的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沉默DKK1、Sost、DKK1+Sost可以提高在MG63細(xì)胞中OPG、CTGF、FGF2蛋白的表達(dá)量，降低TNFα蛋白的表達(dá)量，尤以DKK1、Sost二者同時(shí)沉默時(shí)影響最大，其作用機(jī)制可能是DKK1、Sost沉默后，Wnt信號通路被激活，刺激成骨細(xì)胞MG63增殖活化，促進(jìn)成骨細(xì)胞形成，引起OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白的變化。而使用XCT-790干預(yù)后， XCT-790可通過抑制ERRα的表達(dá)和競爭Wnt信號通路的靶基因，從而降低Wnt信號通路的活性，影響成骨細(xì)胞MG63的形成和增殖，引起OPG、CTGF、FGF2、TNFα蛋白的變化，這與楊冰等[5]的研究結(jié)果一致。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持ERRα促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與增殖，其抑制劑XCT-790能降低成骨細(xì)胞活性的假說。而ERRα與Wnt信號通路之間是競爭拮抗關(guān)系，抑或是協(xié)同關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)二者有協(xié)同作用。Delhon 等[11]認(rèn)為ERRα抑制成骨細(xì)胞分化與增殖，楊冰等[5]研究表明ERRα促進(jìn)成骨細(xì)胞分化與增殖，ERRα在成骨細(xì)胞中的研究結(jié)果不一致的原因可能有3個(gè)方面：①動(dòng)物成骨細(xì)胞與人成骨細(xì)胞非同一種屬，故而實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在分歧，本實(shí)驗(yàn)為人成骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；②ERRα抑制劑XCT-790干預(yù)的時(shí)間不一致；③實(shí)驗(yàn)條件和環(huán)境等方面不一致。

此外，本實(shí)驗(yàn)中XCT-790是通過影響Wnt/β-catenin信號通路還是獨(dú)立發(fā)揮作用，ERRα與Wnt/β-catenin信號通路之間的具體聯(lián)系如何，仍需要進(jìn)一步的研究和探討。