李晨光，趙 虹，季 紅

(1.延邊大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)2013級(jí)，吉林 延吉130000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033)

*通訊作者

萬(wàn)古霉素骨水泥緩釋藥物觀察及檢測(cè)方法建立

李晨光1，趙 虹2*，季 紅2

(1.延邊大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)2013級(jí)，吉林 延吉130000；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033)

萬(wàn)古霉素(vancomycin)為糖肽類抗生素，臨床上用于嚴(yán)重革蘭氏陽(yáng)性菌、耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)、耐甲氧西林的表皮葡萄球菌(MRSE)所致的感染。1970年，Buchholz等發(fā)現(xiàn)抗生素?fù)饺牍撬嘀锌梢孕纬煽股鼐忈屜到y(tǒng)，并通過濃度梯度向周圍長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)釋放。萬(wàn)古霉素骨水泥在臨床人工關(guān)節(jié)置換等術(shù)式的局部抗感染 及其應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究中倍受關(guān)注，本文建立了高效液相色譜法檢測(cè)骨水泥緩釋液中的萬(wàn)古霉素濃度，并對(duì)緩釋濃度梯度變化進(jìn)行觀察。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(Waters，515泵，UV-7500紫外檢測(cè)器，655A-52柱溫箱，7725手動(dòng)進(jìn)樣器，Upper色譜工作站。)Shimadzu AEL-40SM精密分析天平，LG16-W(京立)離心機(jī)。萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，甲醇、乙腈(色譜純，天津四友)，正己烷、磷酸二氫鉀、氯化鈉、碳酸氫鉀、氯化鉀、磷酸氫二鉀、氯化鎂、鹽酸、氯化鈣、硫酸鈉、Tris(分析純，天津化學(xué)試劑)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×250 mm,5 μm),Agilent ZORBAX XDB保護(hù)柱(4×4 mm,5 μm)；流動(dòng)相 甲醇：乙腈：0.05 M KH2PO4(8∶1∶91)，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm，進(jìn)樣量20 μl。

1.2.2 溶液的制備 模擬體液的配制：NaCl 7.996 g,NaHCO30.350 g,KCl 0.224 g,K2HPO4.3H2O 0.228 g,MgCl2。6H2O 0.315 g,1 mol/L HCl 40 ml(pH7.4),CaCl20.278 g,Na2SO40.071g,(CH2OH)3CNH2(Tris pH7.4) 6.057 g 定容于1 000 ml蒸餾水中。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.1 g/L)：精密稱取11 mg萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品，定容于10 ml容量瓶中，4℃保存。100 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取0.1 ml(1.1 g/L)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液加入1 ml模擬體液中，混勻。10 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)液配制：取0.1 ml(100 μg/ml)標(biāo)準(zhǔn)液加入0.9 ml模擬體液中，混勻。流動(dòng)相配制：精密稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4)3.4 g定容至500 ml蒸餾水中，用磷酸調(diào)PH為3.2，配制成0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液。

1.2.3 樣品采集和處理 樣品采集：取潔凈的玻璃容器加入足量的模擬體液，將萬(wàn)古霉素骨水泥樣品浸泡其中，密封容器開口，置于無(wú)菌環(huán)境中，每隔一定時(shí)間搖勻，按設(shè)定時(shí)間點(diǎn)抽取浸泡液，每次抽取0.5 ml樣品，4℃保存。樣品處理：樣品10000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清上樣。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，加模擬體液，使?jié)舛确謩e為0.0,0.1,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 μg/ml，按樣品處理和測(cè)定方法測(cè)定。以萬(wàn)古霉素峰高為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出萬(wàn)古霉素濃度。

2 結(jié)果

2.1 色譜測(cè)定 取空白模擬體液、萬(wàn)古霉素骨水泥在模擬體液中浸出液樣本、萬(wàn)古霉素試驗(yàn)液，在上述實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)處理，測(cè)得HPLC色譜圖。結(jié)果見圖。

萬(wàn)古霉素HPLC色譜圖

2.2 方法的線性范圍 配制濃度為0-10 μg/ml的萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)液，做線性范圍測(cè)定。r=0.992，萬(wàn)古霉素在0-10 μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。

2.3 精確性試驗(yàn) 選擇高、中、低3個(gè)濃度，分別進(jìn)行批內(nèi)和批間測(cè)定，RSD%均小于10%。

2.4 準(zhǔn)確性試驗(yàn) 精密吸取模擬體液，分別加入定量的萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品，依法測(cè)定，回收率96.7%。

2.5 干擾試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)曲線以峰高為計(jì)算系數(shù)，萬(wàn)古霉素骨水泥在模擬體液中的浸出液雜峰不干擾萬(wàn)古霉素峰。

2.6 浸出液濃度測(cè)定及觀察 萬(wàn)古霉素骨水泥浸泡于模擬體液中，定時(shí)振搖并取出樣品，觀察期35天，取得樣品201例，對(duì)上述樣品檢測(cè)，最高濃度7.50 μg/ml，最低濃度0.40 μg/ml，濃度多分布于1.5-5 μg/ml。

3 討論

萬(wàn)古霉素骨水泥在模擬體液的浸出環(huán)境中，模擬體液的多離子、骨水泥本身的合成材料慢性溶解、樣品稀釋度高是影響萬(wàn)古霉素檢測(cè)的主要因素，本文用正己烷試圖提取去掉干擾，發(fā)現(xiàn)干擾物非脂溶性物質(zhì)，應(yīng)用沉淀劑和高速離心比較也沒有較大改善，調(diào)整流動(dòng)相甲醇或乙腈的量，萬(wàn)古霉素目標(biāo)峰明顯升高。隨著觀察取樣時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物不斷溶出，樣品出現(xiàn)變色及絮狀物沉淀，經(jīng)高速離心樣品仍有較好的分離效果，第30天后，樣品變色較多，干擾物質(zhì)雜峰增多。對(duì)骨水泥包裹釋放藥效的觀察不能完全依照藥物濃度，同時(shí)應(yīng)綜合考慮滲出液體物理性狀的改變。

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