梁婷婷，王永坤，王 堯

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a骨科；b泌尿外科)

拓?fù)洚悩?gòu)酶2α受抑癌基因p53的調(diào)控并調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖能力

梁婷婷1，王永坤2a，王 堯2b*

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a骨科；b泌尿外科)

目的 觀察TOP2α對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響以及抑癌基因p53對(duì)TOP2α的調(diào)控能力。方法 以Lipofectamine2000試劑轉(zhuǎn)染針對(duì)p53和非特異性對(duì)照組的siRNA，干擾前列腺癌細(xì)胞C4-2中p53 的表達(dá)，采用Real-time PCR和Western Blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TOP2α的mRNA和蛋白水平表達(dá)變化；采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)p53后檢測(cè)TOP2α蛋白水平的變化，明確p53對(duì)TOP2α表達(dá)的影響；采用BrdU標(biāo)記法計(jì)算并檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)TOP2α表達(dá)后對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，明確TOP2α對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)能力。結(jié)果 干擾p53表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)TOP2α mRNA的表達(dá)明顯升高，說(shuō)明p53可以調(diào)節(jié)TOP2α的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步檢測(cè)干擾p53表達(dá)后，TOP2α的蛋白水平表達(dá)明顯升高；在細(xì)胞內(nèi)，過(guò)表達(dá)p53后檢測(cè)TOP2α的蛋白表達(dá)水平明顯下降；在C4-2細(xì)胞中干擾目標(biāo)基因TOP2α的表達(dá)后，增殖細(xì)胞的百分比從(21.54±1.443)%下降至(13.78±0.4736)%(P<0.05)。同時(shí)，在C4-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TOP2α后，增殖細(xì)胞的百分比從(20.84±2.082%)上升至(33.36±3.244)% (P<0.05)。結(jié)論 在前列腺癌細(xì)胞中，p53可以在mRNA和蛋白水平調(diào)節(jié)TOP2α的表達(dá)，TOP2α具有調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞增殖的能力。

腫瘤；前列腺癌；p53；TOP2α

(ChinJLabDiagn,2017,21:1261)

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2α(TOP2α)在細(xì)胞DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中維持染色體的空間結(jié)構(gòu)具有重要的作用。研究表明，TOP2α可能參與調(diào)控了癌癥細(xì)胞的凋亡和增殖，其與肺非小細(xì)胞肺癌的腦轉(zhuǎn)移可能呈相關(guān)性，TOP2α的表達(dá)升高可以預(yù)測(cè)乳腺癌患者對(duì)于表阿霉素為主化療方案的反應(yīng)性等[1]。TOP2α可能在前列腺癌的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，高表達(dá)TOP2α的前列腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性和增殖能力[2]，但其在前列腺癌細(xì)胞內(nèi)的具體作用機(jī)制尚不清楚。

p53是一個(gè)重要的抑癌基因，其在調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、DNA損傷修復(fù)等方面發(fā)揮了重要的作用[3]。超過(guò)70%的晚期前列腺癌患者的組織標(biāo)本中出現(xiàn)p53基因的表達(dá)缺失[4]。p53是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控大量下游基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用，其在前列腺癌細(xì)胞中調(diào)控的重要效應(yīng)因子是目前的研究熱點(diǎn)之一。本研究旨在檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞中p53的表達(dá)和TOP2α表達(dá)的關(guān)系，以及TOP2α在前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

前列腺癌細(xì)胞系C4-2用含有10%牛胎血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，293T細(xì)胞用含有上述抗生素的DEME培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 RNA干擾目標(biāo)基因的表達(dá)

C4-2細(xì)胞在六孔板中均勻鋪板，24h后按照Lipofectamine2000試劑(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)說(shuō)明書進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組(siCont)和實(shí)驗(yàn)組siRNA劑量均為100pmol。對(duì)照組和TOP2α的siRNA購(gòu)自Santa Cruz公司(sc-36695)，p53 siRNA購(gòu)自IDT公司，序列為:5-AGUGUUUCUGUCAUCCAAAUACUCCAC。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

293T細(xì)胞鋪板生長(zhǎng)24 h后，按照PolyJet轉(zhuǎn)染試劑(購(gòu)自SignaGen公司)說(shuō)明書轉(zhuǎn)染目標(biāo)質(zhì)粒48 h，收集細(xì)胞并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

收集細(xì)胞后進(jìn)行裂解并檢測(cè)蛋白濃度，制備成1 mg/L的蛋白樣品。取適量樣品加入聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶封閉30 mins，4℃一抗孵育過(guò)夜，PBST沖洗10 min×3次，室溫下二抗孵育2 h，PBST沖洗10 min×3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)發(fā)光液后，暗室顯影并洗片保存。 P53抗體購(gòu)自Santa Cruz公司(sc-6243),TOP2α抗體購(gòu)自Santa Cruz公司(sc165986)。

1.5 BrdU標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

C4-2細(xì)胞鋪板于24孔板，RNA干擾實(shí)驗(yàn)干擾目標(biāo)基因表達(dá)后48 h。加入10 μmol/L BrdU孵育2 h，-20℃下Carnoy’s固定液固定20 min，加入2 mol/L HCl和0.1 mol/L Boric酸性液后，3%過(guò)氧化氫處理10 min，10%山羊血清封閉1 h，4℃ BrdU一抗(購(gòu)自Sigma公司，B2531)孵育過(guò)夜，37℃ 二抗(購(gòu)自Life Technologies公司，A10521)孵育1 h。SYTOX Green(購(gòu)自Life Technologies公司， S7020)染色20min。熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1p53調(diào)控了TOP2α在前列腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

在前列腺細(xì)胞C4-2中干擾p53的表達(dá)后，利用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)TOP2α的表達(dá)變化，可見TOP2α的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。說(shuō)明p53可以抑制TOP2α在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。

2.2p53調(diào)控了TOP2α在前列腺癌細(xì)胞中蛋白水平的表達(dá)

在前列腺細(xì)胞C4-2中干擾p53的表達(dá)后，利用WesternBlot檢測(cè)TOP2α在蛋白水平的表達(dá)變化，可見TOP2α的表達(dá)明顯升高。說(shuō)明p53可以抑制TOP2α在蛋白水平的表達(dá)，見圖1。

2.3 在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)p53可以抑制TOP2α的蛋白表達(dá)

在293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入2.0μgGFP-p53后，利用WesternBlot檢測(cè)TOP2α在細(xì)胞中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)TOP2α的表達(dá)明顯受到抑制。說(shuō)明p53的過(guò)表達(dá)可以抑制細(xì)胞中TOP2α的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中同時(shí)轉(zhuǎn)入0.5μgmyc-空載體作為表達(dá)對(duì)照。

2.4TOP2α調(diào)控了前列腺癌細(xì)胞C4-2的增殖能力

在C4-2細(xì)胞中干擾目標(biāo)基因TOP2α的表達(dá)后，檢測(cè)到增殖細(xì)胞的百分比從(21.54±1.443)%下降至(13.78±0.4736)%(P<0.05)。同時(shí)，在C4-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GFP-TOP2α的表達(dá)后，檢測(cè)到增殖細(xì)胞的百分比從(20.84±2.082%)上升至(33.36±3.244)% (P<0.05)。說(shuō)明，TOP2α具有調(diào)控前列腺癌細(xì)胞增殖能力的功能，見圖2。

3 討論

前列腺癌嚴(yán)重威脅男性的生殖健康[5]。隨著普查力度的提高，在我國(guó)前列腺癌發(fā)病率的提升引人矚目。前列腺癌發(fā)病隱匿，常常無(wú)癥狀，在沒有大范圍普查的情況下，我國(guó)超過(guò)60%患者診斷為前列腺癌時(shí)已經(jīng)進(jìn)入癌癥的中晚期，治療手段少并且常伴隨癌癥的轉(zhuǎn)移[6]。盡管近些年來(lái)，對(duì)于前列腺癌的系統(tǒng)治療進(jìn)展迅速，放療、化療包括手術(shù)治療等方式一定程度緩解了患者疾病的進(jìn)展程度，但總體治療效果依然有限[7]。

TOP2α在很多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，例如DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)和染色體的結(jié)構(gòu)維持與重建[8]。體外實(shí)驗(yàn)顯示在細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中TOP2α常高表達(dá)，可以作為增殖性標(biāo)志物之一[9]。

A：在前列腺癌細(xì)胞C4-2中干擾p53的表達(dá)后，TOP2α的mRNA水平表達(dá)明顯上調(diào)(與對(duì)照組比較，*，P<0.05)； B：在前列腺癌細(xì)胞C4-2中干擾p53的表達(dá)后，TOP2α在蛋白水平的表達(dá)明顯上調(diào)；C：在293T細(xì)胞中，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)p53后，TOP2α的表達(dá)明顯降低；

圖1 在前列腺癌細(xì)胞中，p53在mRNA和蛋白水平調(diào)節(jié)了TOP2α的表達(dá)

A：在前列腺癌細(xì)胞C4-2中，過(guò)表達(dá)TOP2α后，檢測(cè)到細(xì)胞的增殖能力明顯升高(與對(duì)照組比較，*,P<0.05) B:干擾目標(biāo)基因TOP2α的表達(dá)后，檢測(cè)到細(xì)胞的增殖能力明顯降低(與對(duì)照組比較，*,P<0.05)

圖2 TOP2α調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的增殖能力

TOP2α表達(dá)的異常經(jīng)常和染色體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定相關(guān)[8]。有報(bào)道認(rèn)為TOP2α的高表達(dá)可能和細(xì)胞的侵襲性相關(guān)并發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤中表達(dá)增高，包括前列腺癌，TOP2α的表達(dá)水平和前列腺癌的Gleason評(píng)分呈正相關(guān)[10]。

p53是一個(gè)重要的抑癌基因和轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤內(nèi)出現(xiàn)功能缺失[11]，超過(guò)70%的晚期前列腺癌出現(xiàn)p53 的功能缺失，但其發(fā)揮的重要作用尚不清楚。作為轉(zhuǎn)錄因子，p53可以調(diào)控多種基因的表達(dá)。前期研究發(fā)現(xiàn)，p53的缺失可以誘導(dǎo)前列腺內(nèi)PIN的發(fā)生(一種癌前病變)，以上研究結(jié)果說(shuō)明p53可能調(diào)控了前列腺癌細(xì)胞的增殖能力并促進(jìn)了前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示p53可以在mRNA和蛋白水平調(diào)控TOP2α在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，說(shuō)明TOP2α可能是p53所調(diào)控的下游蛋白之一。

本研究結(jié)果表明，在前列腺癌細(xì)胞C4-2中干擾p53的表達(dá)，TOP2α在mRNA和蛋白水平表達(dá)會(huì)明顯升高，過(guò)表達(dá)p53后細(xì)胞內(nèi)的TOP2α蛋白表達(dá)會(huì)明顯減弱，TOP2α是p53所調(diào)控的下游基因之一。同時(shí)，干擾TOP2α的表達(dá)后增殖的前列腺癌細(xì)胞明顯減少，而過(guò)表達(dá)TOP2α后增殖細(xì)胞的數(shù)量明顯增強(qiáng)，說(shuō)明，TOP2α在前列腺癌細(xì)胞中可以調(diào)控細(xì)胞的增殖能力。本研究結(jié)果表明，p53可能通過(guò)調(diào)節(jié)目標(biāo)基因TOP2α在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控了細(xì)胞的增殖。

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TOP2α，a novel p53 target gene,regulates proliferation of prostate cancer cells

LIANGTing-ting，WANGYong-kun,WANGYao.

(CancerCenter,TheFirstClinicalHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective To investigate whether Topoisomerase (DNA) II alpha (TOP2α) promote prostate cancer cells proliferation and regulated by p53.Methods After inhibiting expression of p53 by interfering RNA (RNAi) in C4-2 cells using Lipofectamine2000,the mRNA and protein expression level were assessed by Real-time PCR and Western Blot.After transfecting GFP-p53 in 293T cells by according to the manufacturer’s instruction,the expression level of TOP2α was assessed by Western Blot.After knockdown TOP2α by RNAi in C4-2 cells,proliferation was tested by Bromodeoxyuridine incorporation assay (BrdU).Then,the BrdU assay was repeated after transfecting GFP-TOP2α.Results The mRNA and protein level were significant increased after transfection of siRNA against p53.Moreover,proliferation was further decreased from (21.54±1.443)% to(13.78±0.4736)% (P<0.05).At the meantime,after transfectiong GFP-TOP2α,proliferation was further increased from (20.84±2.082%)to(33.36±3.244)% (P<0.05).Conclusion Our findings suggest that p53 regulates the mRNA and protein level of TOP2α,and TOP2α could regulates proliferation ability of C4-2 cells.

Cancer；Prostate Cancer；p53；TOP2α

國(guó)家自然科學(xué)基金(81241027)

1007-4287(2017)07-1261-04

R737.25

A

2017-03-26)

*通訊作者