王 芳,毛 偉,張 濤,劉不盡,廖紅梅,李 維

(重慶市血液中心,重慶400015)

Bh類孟買血型的分子機制研究

王 芳,毛 偉,張 濤,劉不盡,廖紅梅,李 維

(重慶市血液中心,重慶400015)

目的 研究并探討1例Bh類孟買血型血清學特點和分子機制。方法 通過血清學的方法鑒定為類孟買血型，采用SSP方法進行ABO血型基因型的確認，采用SBT方法對FUT1基因序列進行分析，確認基因突變的位置。結(jié)果 血清學結(jié)果確認為Bh分泌型，ABO基因型為O01/B101,FUT1直接測序結(jié)果顯示在nt661處存在有1處錯義突變即C->T，導致221位氨基酸由精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys)。結(jié)論 FUT1第4外顯子編碼區(qū)的錯義突變即nt661處C->T，使221位的精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys)，這個突變型是第36個FUT1突變型，表現(xiàn)為紅細胞H抗原弱表達的類孟買血型，這一種突變型中國人群中為首次報道。

類孟買血型;分子機制;FUT1基因

(ChinJLabDiagn,2017,21:1249)

紅細胞血型系統(tǒng)非常復雜，截止到2016年8月國際輸血協(xié)會(ISBT)命名發(fā)布的紅細胞血型系統(tǒng)共有36個，臨床上除ABO和RH血型系統(tǒng)外最重要的血型系統(tǒng)是第18個血型系統(tǒng)(H血型系統(tǒng)又稱孟買血型系統(tǒng))，只有1個H抗原受控于FUT1基因。H抗原是ABO血型和Lewis血型等的前體物質(zhì)[1]，在人體中有2種存在形式：一種是存在于人類紅細胞等組織細胞膜上的脂溶性H抗原受控于FUT1基因(H)編碼的α-1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(H enzyme)的作用，另一種存在于體液、分泌液中的水溶性H抗原受控于FUT2基因(或Se)編碼的α-1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶 (Se enzyme)的作用，當FUT1和或FUT2基因突變，會導致H抗原的部分或者全部缺失，產(chǎn)生孟買型和類孟買血型兩種稀有血型[2,3]。為了進一步了解本地區(qū)類孟買血型的血清學特點并進一步闡明類孟買血型的分子機制，我們對本地區(qū)一例類孟買血型Bh分泌型進行了分子機制研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 對象 健康男性，28歲，漢族，在醫(yī)院健康檢查時，因血型正反定型不符，醫(yī)院無法判斷血型，該名男性到血液中心輸血研究所采集抗凝血液5 ml和唾液標本3 ml，經(jīng)過血型血清學鑒定和分子生物學的檢測，確定該名男性血型為類孟買血型Bh分泌型。

1.2 試劑和方法

1.2.1 血清學檢測 抗A單克隆抗體、抗B單克隆抗體、抗H單克隆抗體、人反定型用紅細胞試劑、A2細胞(由上海血液生物醫(yī)藥有限公司)，抗-Lea 、抗-Leb(美國Immuncor公司)，抗A單克隆抗體、抗B單克隆抗體(長春博德生物制品有限公司)，人源抗A、抗B抗體、抗AB抗體(中國醫(yī)學科學院成都輸血研究所)。A B O 血型鑒定、唾液中 ABH 血型物質(zhì)測定試驗、Lewis 血型鑒定按照相關(guān)試劑說明書及《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行操作。

1.2.2 基因檢測 ①DNA提取試劑 用Puregene Blood Core Kit B DNA提取試劑(德國Qiagen公司)，提取EDTA-K2抗凝全血標本中基因組DNA。濃度大于20 ng/μL，260/280比值在1.6～1.9的標本可用于檢測，按照試劑盒說明書進行操作。②ABO血型基因SSP檢測 采用ABO-TYPE SSP基因分型試劑盒(德國BAG公司)，將提取的符合實驗條件的DNA，按基因分型試劑盒說明書進行操作。③FUT1基因測序分析 FUT1基因擴增和測序引物參照FUT1基因序列，采用計算機輔助設(shè)計、上海申能博彩公司合成。按文獻[4]的方法進行擴增、電泳、克隆和直接測序分析。

1.3 設(shè)備 Gene Quant Pro型DNA 濃度測定儀(英國)，ABI3730型基因測序儀和ABI PE9700型擴增儀(美國) POWER PAC 3000型電泳儀(美國)，KST-5500型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京東迅)、血型血清學離心機 KA -2200 SEROMAMTIC II(日本KUBOTA)

2 結(jié)果

2.1 血清學結(jié)果 這名健康男性的血清學檢測結(jié)果見表1、表2，通過反應格局綜合分析，這名健康男性血型為稀有的類孟買血型：Bh分泌型，Lewis表型為 Le(a-b+)。

表1 ABO血型檢測結(jié)果

表2 H和Lewis血型檢測結(jié)果

2.2 ABO血型基因檢測結(jié)果 根據(jù)電泳膠圖中特異性條帶和試劑盒的格局表綜合分析這名健康男性的基因型為ABO* O01/B101，電泳膠圖見圖1。

2.3 FUT1基因直接測序結(jié)果 將直接測序結(jié)果與FUT1數(shù)據(jù)庫進行比對發(fā)現(xiàn)在nt661處FUT1基因存在有1處錯義突變即C->T(見圖2)，導致221位的氨基酸由精氨酸(Arg)變?yōu)榘腚装彼?Cys)， H酶活性減弱甚至是失活，通過與dbRBC BGMT數(shù)據(jù)庫的比對，這種突變導致的類孟買血型是第36個類孟買血型(見圖3)。

注：1：O01；2、non O01；3、O03；4、non O03；5、B101；6、non B101；7、A201；8、non A201 陽性條帶：1,2,4,5,6,8，根據(jù)試劑盒格局表ABO血型基因分型結(jié)果為ABO*001/B101

圖1 ABO 血型基因分型結(jié)果

3 討論

H缺乏表現(xiàn)型(H-deficient)又被稱為類孟買血型是指紅細胞完全或部分缺乏H抗原而在唾液等分泌液中有ABH物質(zhì)的一種稀有表現(xiàn)型，引起H抗原缺乏的原因主要為控制紅細胞H抗原合成的FUT1基因突變導致H抗原合成障礙，從而導致AB 血型抗原合成異常，引起ABO 血型鑒定錯誤和輸血困難，因此在輸血實踐中具有重要的臨床意義[5,6]。

FUT1基因位于19q13.3，全長7 380 bp，有4個外顯子，具有編碼蛋白能力的序列位于第4外顯子，由1098個堿基組成，編碼365個氨基酸，F(xiàn)UT1基因編碼α-1,2-巖藻糖糖基轉(zhuǎn)移酶，將底物GDP-L-半乳糖上的巖藻糖基轉(zhuǎn)移到前體糖鏈分子末端半乳糖基的C-2位形成H抗原，H抗原表達在紅細胞系、表皮的上皮細胞以及血管內(nèi)皮細胞，無活性的FUT1基因在純合子狀態(tài)不能表達H抗原[7]。類孟買血型具有明顯的遺傳異質(zhì)性和區(qū)域性，根據(jù)dbRBC BGMT公布的數(shù)據(jù)和目前國內(nèi)文獻分析來看，目前在不同人種(群)中共發(fā)現(xiàn)60種FUT1基因，F(xiàn)UT1基因異常包括缺失、錯義突變和插入突變等，且大部分都是錯義突變。中國人群發(fā)現(xiàn)10余種FUT1基因型，其中最常見的FUT1基因型是h1：FUT1 547-552delAG；h2：FUT1880-882delTY；h3：FUT1658T等[8-10]，本次報道的FUT1基因突變是錯義突變，這個突變型是第36個FUT1突變型，表現(xiàn)為紅細胞上H抗原弱表達的類孟買血型，是非常稀有的型別，在澳大利亞人中發(fā)現(xiàn)，這一種突變型中國人群中為首次報道。在nt661C->T，導致221位的氨基酸由精氨酸(Arg)變?yōu)榘腚装彼?Cys)，精氨酸(Arg)為堿性氨基酸，等電點(pI)值為l0．76，而半胱氨酸(Cys)為中性氨基酸，pI值為5.05，這2個氨基酸在物理化學性質(zhì)方面差異很大，推測這個氨基酸的取代可能降低α-1,2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶的生物活性，使紅細胞上的H抗原減弱，推測由于該名男子帶有正常的B基因，能產(chǎn)生正常的B酶(α-1,3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)，會將紅細胞上弱H抗原為底物，全部轉(zhuǎn)化為B抗原，因此紅細胞上有較多的B抗原，而H抗原缺乏。

備注：測序結(jié)果顯示FUT1在nt661處存在有1處錯義突變即C->T

圖3 dbRBC BGMT數(shù)據(jù)庫中第36個FUT1基因

目前類孟買血型的確認主要是依靠血清學實驗，它的血清學基本特點為：紅細胞表面有弱的A、B抗原，與高效價抗-A或抗-B長時間反應可出現(xiàn)弱凝集，或可通過吸收放散實驗檢出，與抗-H不發(fā)生反應，但與孟買型的抗-H有弱凝集，血清中有抗-HI冷抗體，唾液中可檢出少量的ABH血型物質(zhì)[11]。實驗室進行血清學檢測時發(fā)現(xiàn)不同廠家的ABO血型試劑在檢測時有差異，多次離心和4℃放置的檢測能力有差異，但在4℃放置5分鐘后均能檢測出較強的B抗原，血清中檢出抗A1和抗A抗體未檢出抗-HI抗體，提示在實際工作中為防止漏檢，可選擇兩種以上不同廠家的血型試劑，并為了防止類孟買血型的漏檢應在疑難血型檢測策略中增加抗-H血型試劑的使用。

血型的正確定型在臨床輸血中具有重要的臨床意義，在臨床實踐中為避免亞型、孟買型和類孟買型的漏檢，為患者提供安全、可靠的血液，對于血型有疑問的血液標本，建立合適的血型篩查策略具有重要的意義。

致謝： 感謝浙江省血液中心輸血研究所許先國老師的指導和大力支持！

[1]胡麗華，主編.臨床輸血學檢驗[M].第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社.2013：21-22.

[2]丹尼爾主編，朱自嚴主譯.人類血型[M].原書第2版，北京：科學出版社，2007：9-19.

[3]和艷敏，許先國，朱發(fā)明等.2例類孟買表型的分子機理研究[J].中國實驗血液學雜志,2007,15(3)：626.

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[6]梁延連，蘇宇清，喻 瓊,等.類孟買型在兩個近親與隨機婚配家系中的遺傳特點[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志,2009,24(3)：48.

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Study on the molecular mechanism of Bhpara- Bombay phenotype

WANGFang,MAOWei,ZHANGTao,etal.

(ChongqingBloodCenter,Chongqing400015,China)

Objective to study serological characteristics of blood type and molecular mechanism of Bhpara-Bombay phenotype.Methods ABO and H antigens were detected with routine serological technique,SSP method and the direct sequencing method were used respectively to the confirm of ABO blood group genotypes and FUT1 gene sequence analysis.Results Serological results confirmed as Bhsecretory type，the result of ABO gene was O01/B101,Direct sequencing indicated that FUT1 sequnce contained a missence mutation(C->T) at nt661,which could cause the change of amino acid at position 221Arg→Cys.Conclusion The mutantion of FUT1 gene at nt 661 was the 36th mutant,showed the RBC weak H antigen expression type of para-Bombay phenotype,this kind of mutant China reported for the first time in the crowd.

para-Bombay;Molecular mechanism;FUT1gene

1007-4287(2017)07-1249-04

R457.1+1

A

2016-10-21)