劉永年，蔣 虹，朱雪玲，鞏海鳳，蘇占海，楊生璽

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院；3.青海大學(xué)研究生院；4.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部)

外源性一氧化氮對(duì)merlin調(diào)節(jié)的胃癌細(xì)胞增殖的影響*

劉永年1，蔣 虹2，朱雪玲3，鞏海鳳3，蘇占海4，楊生璽4

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院；3.青海大學(xué)研究生院；4.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部)

目的 通過研究胃癌中一氧化氮對(duì)擴(kuò)散侵襲相關(guān)因子merlin的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步闡明腫瘤獲得性表達(dá)一氧化氮后其惡性增殖的可能作用機(jī)制。方法 外源性一氧化氮由硝普鈉供給，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，利用Lipofectamine 2000將merlin重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，并用Western blot蛋白印跡法檢測(cè)merlin重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，利用NP-40裂解液提取細(xì)胞總蛋白。結(jié)果 與0.1 μmol/L濃度組相比，1 mmol/L濃度組的NO對(duì)胃癌細(xì)胞增殖有明顯抑制作用。與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染merlin-1對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用(P<0.01)。merlin-1與NO對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的交互作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 一氧化氮和merlin-1對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，但尚不能認(rèn)為merlin-1與一氧化氮的交互作用對(duì)胃癌細(xì)胞增殖有影響。

胃癌 細(xì)胞 一氧化氮 merlin 增殖

一氧化氮(nitric oxide，NO)是活躍在人體內(nèi)的具有多種生物學(xué)活性的一種小分子物質(zhì)，它在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲等方面具有雙重作用：既有促進(jìn)作用又有抑制作用。這種雙重作用主要取決于NO濃度和腫瘤微環(huán)境[1]。體內(nèi)NO來源于NO合酶(NOS)，根據(jù)其不同的特點(diǎn)，可將NOS分為神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘導(dǎo)型NOS(iNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS)[2]。Keklikoglu 等[3]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、前列腺癌等許多腫瘤組織中，均可同時(shí)表達(dá)上述三種NOS，其中iNOS表達(dá)上調(diào)明顯(iNOS與腫瘤的分化程度密切相關(guān))。也有研究發(fā)現(xiàn)，nNOS抑制神經(jīng)干細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤治療[4]，p53缺乏可上調(diào)eNOS，最終導(dǎo)致RNS介導(dǎo)的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化和侵襲[5]。Cullis等[6]將iNOS基因轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株后，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)iNOS過度表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及新生血管的生成。

腫瘤除了惡性增殖外，還具有向周圍組織繼續(xù)侵襲的特點(diǎn)，此過程和細(xì)胞骨架系統(tǒng)的重組關(guān)系密切。與細(xì)胞骨架重組緊密相關(guān)的蛋白莫林(merlin)由抑癌基因神經(jīng)纖維瘤-2型基因(neurofibromatosis 2，NF2)編碼產(chǎn)生，該基因突變會(huì)造成其產(chǎn)物merlin蛋白變性，最終喪失了它對(duì)腫瘤的抑制功能[7，8]。merlin蛋白是4.1家族蛋白成員之一，此蛋白家族還包括ezrin(埃茲蛋白)、radixin(根蛋白)和moesin(膜突蛋白)，它們?cè)诩?xì)胞骨架的重組、細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和增殖方面發(fā)揮著重要的作用[9，10]，但是在此過程中牽涉到哪些因子、蛋白，以及相互之間如何進(jìn)行作用等均未闡明。很多腫瘤組織獲得性表達(dá)NO，而且NO也參與細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)以及調(diào)節(jié)和細(xì)胞侵移相關(guān)的因子，如NO能誘導(dǎo)侵襲相關(guān)因子血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(VASP)在Ser-157和Ser-239處的磷酸化，進(jìn)而影響細(xì)胞骨架重組[11]。本課題擬通過研究外源性NO對(duì)NF2基因產(chǎn)物merlin-1蛋白磷酸化/去磷酸化生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用，以期發(fā)現(xiàn)NO、merlin-1在胃癌細(xì)胞惡性增殖過程中的可能分子機(jī)制，最終為胃癌細(xì)胞的增殖提供重要的分子和細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

正常胃粘膜細(xì)胞株GES-1、胃癌細(xì)胞株BGC-823(南京凱基生物公司，中國)，改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(北京賽默飛世爾生物公司，中國)，HEPES緩沖液(北京Solarbio公司，中國)，青霉素/鏈霉素雙抗(p/s，上海生工生物公司，中國)，胎牛血清、0.25%胰酶(Thermo Fisher 公司，美國)，Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，英國)，PVDF膜、NP-40裂解液、轉(zhuǎn)膜液、電泳液粉末(北京碧云天生物公司，中國)，小鼠HAtag單克隆抗體(Abcam公司，英國)，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IGg(北京中山金橋生物公司，中國)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京Solarbio公司，中國)，硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP，上海生工生物公司，中國)。超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱(ThermoFisher 公司，美國)，倒置顯微鏡(上海萬衡公司，中國)，xMark全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司，美國)，利康落地式離心機(jī)(上海力申公司，中國)，MTT和SNP(北京碧云天生物公司，中國)。蛋白質(zhì)電泳、電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

GES-1細(xì)胞株用改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(10%胎牛血清，1% P/S雙抗)培養(yǎng)，BGC-823用RPMI-1640培養(yǎng)液(10%胎牛血清，1% P/S雙抗，1% HEPES緩沖液)培養(yǎng)，在5% CO2、37 ℃環(huán)境下行無菌培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞富集度達(dá)到75%左右，用0.25%的胰酶消化成單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

MTT法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GES-1、BGC-823細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，以4×104個(gè)/mL的濃度接種于24孔板中，每孔500 μL，培養(yǎng)24 h后將pcDNA3.1+-merlin-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。8 h后，將所有培養(yǎng)液更換為不同濃度的SNP溶液，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組分別設(shè)不同濃度SNP組(0.1umol/L、1mmol/L)，每個(gè)濃度組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后每孔加入5 mg/mL MTT溶液30 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，之后加入400 μL Formazan溶解液過夜溶解。在酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。利用結(jié)果分析外源性NO壓力下merlin-1對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外源性NO壓力下merlin-1對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1增殖的影響

2.1.1 外源性NO對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1增殖的影響

SNP的主效應(yīng)F=37.569，P<0.01，表示0.1 umol/L濃度組與1 mmol/L濃度組對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1增殖的影響不同，結(jié)合均數(shù)比較結(jié)果(表1)，1 mmol/L濃度與0.1 μmol/L濃度相比，SNP對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1細(xì)胞增殖的抑制作用較強(qiáng)。

2.1.2 merlin-1對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1增殖的影響

Merlin-1的主效應(yīng)F=45.214，P<0.01，表示是否轉(zhuǎn)染merlin-1對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1增殖的影響不同，結(jié)合均數(shù)比較結(jié)果(表1)，轉(zhuǎn)染merlin-1對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1的增殖具有抑制作用。

2.1.3 外源性NO與merlin-1的交互作用

Merlin-1與SNP的交互作用F=0.356，P>0.05，尚不能認(rèn)為merlin-1與NO的交互作用對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1的增殖有影響(圖1，兩直線幾乎平行，說明兩因素交互作用很小)。

Table 1 MTT absorbent in GES-1 cells through factorial ±s)

圖1 melin-1與NO作用于GES-1的交互作用示意圖

Figure 1 The interaction between merlin-1 and NO on the GES-1 cells

2.2 外源性NO壓力下merlin-1對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的影響

2.2.1 外源性NO對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的影響

Merlin-1的主效應(yīng)F=38.124，P<0.01，表示0.1 μmol/L濃度組與1 mmol/L濃度組對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的影響不同，結(jié)合均數(shù)比較結(jié)果(表2)，1 mmol/L濃度與0.1 μmol/L濃度相比，SNP對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞增殖的抑制作用較強(qiáng)。

2.2.2 merlin-1對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的影響

SNP的主效應(yīng)F=58.478，P<0.01，表示是否轉(zhuǎn)染merlin-1對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的影響不同，結(jié)合均數(shù)比較結(jié)果(表2)，轉(zhuǎn)染merlin-1對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖具有抑制作用。

2.2.3 外源性NO與merlin-1的交互作用

Merlin-1與SNP的交互作用F=0.214，P>0.05，尚不能認(rèn)為merlin-1與NO的交互作用對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖有影響(圖2，兩直線幾乎平行，說明兩因素交互作用很小)。

Table 2 MTT absorbent in BGC-823 cells through factorial ±s)

圖2 melin-1與NO作用于BGC-823的交互作用示意圖

Figure 2 The interaction between merlin-1 and NO on the BGC-823 cells

3 討論

為研究NO調(diào)節(jié)的信號(hào)途徑及涉及的相關(guān)因子，一般利用NO生成劑或可釋放產(chǎn)生NO的化合物來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)生NO的目的。能釋放產(chǎn)生NO的化合物通常被稱作NO供體(NO donor)，NO供體在許多疾病的治療尤其是腫瘤治療中受到越來越多的關(guān)注[12]，其釋放產(chǎn)生NO后可激活下游NO相關(guān)信號(hào)途徑及生物學(xué)功能。Rapozzi等[13]發(fā)現(xiàn)，DETA/NO作為NO供體能有效提供抗腫瘤的光能療法的效率。目前常用的NO供體有3-morpholinosydnonimine(SIN-1)、Sodium Nitroprusside(SNP)和S-nitroso-N-acetylpenicillamine(SNAP)，因其可以穩(wěn)定產(chǎn)生NO而常用于各種實(shí)驗(yàn)。NO生成后，被氧化成NO2，最終以NO2-、NO3-的形式存在，通過檢測(cè)培養(yǎng)液中NO2-+NO3-的總含量，可以反映培養(yǎng)液中的NO水平[14]。利用此原理，本實(shí)驗(yàn)通過NO檢測(cè)盒，檢測(cè)培養(yǎng)液中NO濃度，結(jié)果顯示，培養(yǎng)液中NO濃度隨著SNP濃度的增高而增高，提示SNP能有效提高培養(yǎng)液中NO濃度。

merlin蛋白含有兩種主要的亞型，亞型1和亞型2，亞型1包含595個(gè)氨基酸殘基，亞型2包含590個(gè)氨基酸殘基，亞型1和亞型2最大的區(qū)別在于它們的羧基端不同[15]。在結(jié)構(gòu)上，merlin蛋白以頭-尾相連的方式進(jìn)行折疊，導(dǎo)致其分子構(gòu)象發(fā)生改變，形成“關(guān)閉”或“開放”的狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮其抑制腫瘤的功能，若磷酸化merlin蛋白，那么首尾連接形成的“開放”狀態(tài)就會(huì)被打破并使其失活，由于亞型2不能形成頭尾連接的結(jié)構(gòu)，故而它沒有抑制腫瘤的作用[16，17]。另外merlin保守結(jié)構(gòu)域FERM，以及merlin-1、merlin-2都顯示出和Rho-GDI極高的親和性[18]，這也可能是merlin參與調(diào)節(jié)Rho GTP酶誘導(dǎo)的信號(hào)通道的重要證據(jù)之一。merlin蛋白的功能受磷酸化作用的調(diào)節(jié)，磷酸化作用使merlin 蛋白N-C末端發(fā)生折疊障礙，導(dǎo)致其失活及再定位[19]。

為了進(jìn)一步研究merlin與NO在腫瘤細(xì)胞增殖中是否具有相互作用，本實(shí)驗(yàn)利用NO供體SNP作為外源性NO的來源，同時(shí)轉(zhuǎn)染merlin-1的重組質(zhì)粒，觀察兩因素在胃癌細(xì)胞增殖中的交互作用。由于merlin-2不能形成頭尾連接的結(jié)構(gòu)，沒有抑制腫瘤的作用。因此，實(shí)驗(yàn)中只轉(zhuǎn)染了merlin-1的重組質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)利用正常胃粘膜細(xì)胞GES-1作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NO對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖均具有抑制作用(P<0.01)。轉(zhuǎn)染merlin-1后，與未轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞增殖被抑制(P<0.01)，表明meilin-1對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖均具有抑制作用。

本研究通過析因?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)merlin-1與NO對(duì)正常胃粘膜細(xì)胞GES-1及胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞增殖均沒有交互作用(P>0.05)，表明NO對(duì)merlin調(diào)節(jié)的胃癌細(xì)胞的增殖影響不大，但NO對(duì)merlin調(diào)節(jié)的其他細(xì)胞生物學(xué)功能(如細(xì)胞粘附、細(xì)胞骨架重組等)是否具有影響，仍需進(jìn)一步研究。

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收稿日期 2016-12-13

The Influence of Exogenous Nitric Oxide on The Proliferation of Gastric Cancer Cells Regulated By Merlin#

LIU Yong-nian1，JIANG Hong2，ZHU Xue-ling3，GONG Hai-feng3，SU Zhan-hai4，YANG Sheng-xi4

(1.Qinghai University Medical College；2.Qinghai University Affiliated Hospital；3.Qinghai University Graduate School； 4.Department of Basic Medical Sciences，Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai，810001)

Objective To study the regulating effect of nitric oxide on merlin，a diffusion-related factor，thereby clarifying the major mechanism of tumor malignant proliferation after induced expression of nitric oxide.Methods Exogenous nitric oxide was produced by the nitric oxide donor sodium nitroprusside( SNP).Detected cell proliferation by MTT assay.Lipofectamine 2000 was used to transfect merlin recombinant plasmid into cells.The transfection efficiency of merlin recombinant plasmid was detected by Western blot.We used NP-40 lysis buffer to extract total cellular protein.Results The proliferation of gastric cancer cells was inhibited in 1 mmol/L concentration group compared to 0.1 μmol/L concentration group(P<0.01).The proliferation of gastric cancer cells with transfected merlin-1 was significantly inhibited compared to non-transfected group(P<0.01).The interaction of merlin-1 and NO on the proliferation of gastric cancer cells had no statistical significant.Conclusion Both nitric oxide and merlin-1 can inhibit the proliferation of gastric cancer cells，but we can not believe that the interaction of merlin-1 and NO has any impact on the proliferation of gastric cancer cells.

Gastric Cancer Cell Nitric oxide Merlin Proliferation

2016-12-13

R363.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.02.002

#：青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2016-ZJ-705) 劉永年(1959～)，男，青海籍，教授，碩導(dǎo)