張改平

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院 河南 鄭州 450002)

動(dòng)物免疫潛力與新概念疫苗

張改平

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院 河南 鄭州 450002)

當(dāng)前疫苗研究已由利用微生物培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)常規(guī)疫苗，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)基因工程疫苗的傳統(tǒng)疫苗學(xué)，發(fā)展到利用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)，研發(fā)分子疫苗或結(jié)構(gòu)疫苗的反向疫苗學(xué)和結(jié)構(gòu)疫苗學(xué).針對動(dòng)物免疫壓力過大的突出問題，提出“動(dòng)物免疫潛力”新概念，建立新概念疫苗理論體系，并致力于動(dòng)物疫病新概念疫苗研究.

動(dòng)物疫?。?免疫潛力； 新概念疫苗

0 引言

疫苗免疫是動(dòng)物疫病防控的重要手段之一，科學(xué)、合理使用疫苗保障了國家疫病防控政策的有效實(shí)施.常規(guī)疫苗在當(dāng)前的動(dòng)物疫苗市場仍然占主導(dǎo)地位，在動(dòng)物傳染病的防控過程中發(fā)揮了重要作用.目前我國常規(guī)疫苗種類繁雜、生產(chǎn)廠家眾多，疫苗質(zhì)量沒保障，良莠不齊.主要問題有：疫苗有效抗原成分低(雜質(zhì)多、未純化)、疫苗產(chǎn)品缺少質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)(生產(chǎn)和檢驗(yàn)工藝難以標(biāo)準(zhǔn)化)、疫苗使用成本較高(需低溫貯藏和運(yùn)輸)、用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的滅活疫苗和減毒活疫苗存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)(滅活不徹底、毒株返強(qiáng)或重組)等突出問題[1-2].為此，革命性升級疫苗產(chǎn)品，研制安全、高效、微量、精準(zhǔn)的新型疫苗，實(shí)現(xiàn)疫苗的更新?lián)Q代，是動(dòng)物疫病防控的有效措施，是畜牧業(yè)高效發(fā)展的保障.

1 疫苗研究發(fā)展歷程

圖1 主要疫苗研發(fā)技術(shù)發(fā)展進(jìn)程[15]Fig.1 Development of major vaccine research and preparation technologies[15]

疫苗(Vaccines)的概念最早來源于英國醫(yī)生愛德華·琴納(Edward Jenner)，他發(fā)明了牛痘接種預(yù)防天花，被稱為“疫苗之父”；另一位疫苗學(xué)先驅(qū)是法國的路易斯·巴斯德(Louis Pasteur)，他創(chuàng)建了炭疽減毒活疫苗和狂犬病活病毒疫苗，其后霍亂和傷寒滅活菌苗以及類毒素(白喉和破傷風(fēng))亞單位疫苗得以發(fā)展，形成以減毒活疫苗和滅活疫苗為主的常規(guī)疫苗[3].減毒活疫苗經(jīng)歷了從使用動(dòng)物病毒到物理致弱、動(dòng)物或雞胚傳代和細(xì)胞培養(yǎng)傳代致弱的發(fā)展過程，滅活疫苗則從全菌或病毒滅活向類毒素、菌體提取物、純化多糖和蛋白質(zhì)發(fā)展[4].隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)、生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，新型疫苗研究已由傳統(tǒng)的常規(guī)疫苗和基因工程疫苗向結(jié)構(gòu)疫苗和靶向疫苗發(fā)展.人們根據(jù)疫苗發(fā)展進(jìn)程將疫苗學(xué)分為3個(gè)階段：一是傳統(tǒng)疫苗學(xué)(conventional vaccinology)，包括常規(guī)疫苗和基因工程疫苗，即利用微生物培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)常規(guī)疫苗和利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)基因工程疫苗，該技術(shù)已成功應(yīng)用于多種疫苗研發(fā)，但對難以培養(yǎng)或缺乏優(yōu)勢保護(hù)性抗原的微生物疫苗尚無有效解決方案；二是反向疫苗學(xué)(reverse vaccinology)，即利用基因組學(xué)和泛基因組學(xué)技術(shù)更高效地選擇候選疫苗，該技術(shù)最早應(yīng)用基于對B型腦膜炎球菌的基因組學(xué)分析，隨后泛基因組學(xué)、比較基因組學(xué)和消減基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)、分子流行病學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)結(jié)合應(yīng)用于疫苗靶抗原的精確選擇，并且鑒定了腦膜炎球菌H因子結(jié)合蛋白等新的毒力因子；三是結(jié)構(gòu)疫苗學(xué)(structural vaccinology)，將組學(xué)技術(shù)與結(jié)構(gòu)生物學(xué)有機(jī)結(jié)合，利用高解析度的結(jié)構(gòu)信息，對保護(hù)性抗原進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化，去除無關(guān)成分而保留保護(hù)性表位，進(jìn)而研制更高效、廣譜、安全、穩(wěn)定的新型疫苗，深入了解抗原免疫原性和免疫優(yōu)勢的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)有助提高疫苗免疫效率和范圍[5-8].在結(jié)構(gòu)疫苗研究方面，Jardine等根據(jù)人免疫缺陷病毒(HIV)廣譜中和抗體(bNAbs)VRC01與gp120的晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了靶向種系抗體的eOD-GT6抗原，其具有與多重VRC01抗體及其種系前體的結(jié)合構(gòu)象，將eOD-GT6免疫原與自組裝蛋白連接形成病毒樣顆粒，可激活種系和成熟B細(xì)胞產(chǎn)生中和性抗體[9-11].Nuccitelli等將不同菌株B型鏈球菌BP-2a蛋白D3結(jié)構(gòu)域串聯(lián)形成嵌合免疫原，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對6個(gè)菌株的廣譜免疫保護(hù)[11].Kanekiyo等將流感病毒HA蛋白與幽門螺桿菌鐵蛋白融合，形成自組裝納米疫苗，誘導(dǎo)產(chǎn)生H1N1的廣譜中和性抗體[12].Correia等證明利用計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)的呼吸道合胞病毒中和表位多肽可以維持天然蛋白的表位空間構(gòu)象，并誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)的中和性抗體，其與天然蛋白的結(jié)合構(gòu)象與原始單抗極為相似[13].Liu等設(shè)計(jì)合成靶向淋巴結(jié)的CpG-DNA/多肽分子疫苗，疫苗可在淋巴結(jié)富集并能激活T細(xì)胞反應(yīng)，增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)[14].圖1是當(dāng)前主要疫苗研發(fā)技術(shù)從科學(xué)發(fā)現(xiàn)到技術(shù)轉(zhuǎn)化和產(chǎn)品研發(fā)所需要的發(fā)展進(jìn)程，分別表示相關(guān)技術(shù)從科學(xué)發(fā)現(xiàn)到研發(fā)技術(shù)成熟和尚待發(fā)展的時(shí)間[15]，提示疫苗研究進(jìn)入新的發(fā)展階段，同時(shí)也面臨巨大挑戰(zhàn).

2 動(dòng)物免疫潛力的概念

當(dāng)前動(dòng)物疫苗種類繁多，而且動(dòng)物免疫次數(shù)多、免疫劑量大，使動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)承受壓力過大，從而導(dǎo)致免疫保護(hù)效果欠佳.針對這一突出問題，我們提出“動(dòng)物免疫潛力”的新概念：認(rèn)為動(dòng)物擁有巨大的免疫潛力，同時(shí)這種免疫潛力又是有限的[2].在正常情況下，動(dòng)物機(jī)體生理能力是用于生產(chǎn)的，若過多用于免疫，就會(huì)影響生產(chǎn)，所以使用疫苗的種類和次數(shù)不能超出動(dòng)物的免疫潛力.假如一個(gè)動(dòng)物的免疫潛力是1 000點(diǎn)，在正常情況下，預(yù)防一種傳染病只需50～100點(diǎn)，理論上推算至少可以預(yù)防100種這個(gè)動(dòng)物的傳染病，其免疫潛力很大，足以滿足動(dòng)物疫病防控的需要.但由于傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的疫苗過于混亂、與免疫無關(guān)的雜質(zhì)太多，導(dǎo)致理論上用100點(diǎn)的免疫潛力就可以預(yù)防的一種動(dòng)物傳染病，在實(shí)際中卻要消耗3 000點(diǎn)免疫潛力才可以達(dá)到免疫保護(hù)的目的，從而導(dǎo)致該動(dòng)物10 000點(diǎn)的免疫能力并不能預(yù)防100種傳染病，而是只能預(yù)防3種，這不是疫苗免疫本身有問題，而是加載的無效疫苗成分太多，無謂地消耗了大量的動(dòng)物免疫潛力.因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中常出現(xiàn)因免疫過度而導(dǎo)致免疫效果差的現(xiàn)象，就會(huì)出現(xiàn)類似1+2=3，而3+2<3的結(jié)果.

3 新概念疫苗研究

在我國現(xiàn)有的動(dòng)物飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下，在養(yǎng)殖過程中實(shí)現(xiàn)完全的疫病凈化非常困難，用疫苗防控動(dòng)物疫病仍是必需的手段，但當(dāng)前的動(dòng)物疫苗產(chǎn)品中存在過多的無效成分，極大浪費(fèi)了動(dòng)物的生理能力和免疫能力，致使疫苗免疫效果差、疫病防控不力.因此，應(yīng)針對這一問題，開展全新的新概念疫苗研究，來實(shí)現(xiàn)節(jié)省動(dòng)物的免疫能力，同時(shí)提高免疫保護(hù)效果的目的，讓3+2=5 而不是3+2=0.

人們常說的新概念疫苗多以新技術(shù)命名，如基因工程疫苗、基因疫苗、亞單位疫苗、病毒空殼疫苗等.我們根據(jù)“動(dòng)物免疫潛力”新概念建立了以動(dòng)物實(shí)際需求進(jìn)行分子疫苗設(shè)計(jì)的“新概念疫苗”理論，其基本原則是精確、微量、純化、安全、高效，不浪費(fèi)動(dòng)物免疫力.具體內(nèi)容為：(1) 精確：包括抗原位點(diǎn)、表位結(jié)構(gòu)和免疫啟動(dòng)的精確設(shè)計(jì)和激活；(2) 微量：要求抗原量在微克級即可產(chǎn)生有效保護(hù)；(3) 純化：高純度，雜質(zhì)極少；(4) 安全：實(shí)現(xiàn)真正的生物安全(不含基因)，無病原擴(kuò)散；(5) 高效：多種疫苗聯(lián)合使用，占用動(dòng)物極少的免疫潛力但能實(shí)現(xiàn)有效保護(hù).實(shí)現(xiàn)了疫苗真正意義的高效(聯(lián)合使用)，其核心就是不浪費(fèi)動(dòng)物免疫能力.理想的新概念疫苗應(yīng)該具備6個(gè)特點(diǎn)：(1) T、B淋巴細(xì)胞協(xié)調(diào)工作；(2) 高度安全；(3) 真正高效；(4) 容易保存；(5) 精確、微量、純化、不浪費(fèi)免疫能力；(6) 低成本工廠化合成生產(chǎn).

我們研究團(tuán)隊(duì)致力于動(dòng)物病毒新概念疫苗研究，系統(tǒng)開展了動(dòng)物病毒的免疫識別研究，發(fā)現(xiàn)了雞傳染性法氏囊病病毒、雞新城疫病毒、禽流感病毒和豬瘟病毒等主要?jiǎng)游锊《镜鞍椎南盗蠦細(xì)胞抗原表位，并在GenBank注冊B細(xì)胞抗原表位序列12 個(gè)，繪制了主要?jiǎng)游锊《镜鞍椎腂細(xì)胞表位圖譜；同時(shí)也開展了動(dòng)物MHCI與CTL表位、動(dòng)物MHCII與Th表位研究，并分析其免疫識別規(guī)律和免疫保護(hù)效力，為新概念疫苗研究奠定了基礎(chǔ)[16-21].

新概念疫苗的研究策略見圖2，包括疫苗的分子設(shè)計(jì)、疫苗抗原的重組表達(dá)、結(jié)構(gòu)化疫苗裝配和通用佐劑等.新概念疫苗設(shè)計(jì)要從B細(xì)胞的識別與抗體反應(yīng)、T細(xì)胞的識別與CTL反應(yīng)、中和抗體與非中和抗體反應(yīng)，以及免疫佐劑(Th反應(yīng)的通用性和Toll樣受體的作用)等因素綜合考慮.根據(jù)動(dòng)物病毒抗原表位的結(jié)構(gòu)和識別規(guī)律，設(shè)計(jì)系列T/B細(xì)胞疫苗和免疫佐劑，并利用多種表達(dá)系統(tǒng)對設(shè)計(jì)抗原進(jìn)行高效表達(dá)和鑒定.我們利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的結(jié)構(gòu)抗原，并制備了病毒樣顆粒，取得良好免疫效果[22].同時(shí)，與西北農(nóng)林科技大學(xué)合作開展結(jié)構(gòu)抗原的乳腺生物反應(yīng)器研究，相關(guān)抗原基因完成核移植，并獲得妊娠母羊；與武漢大學(xué)合作開展結(jié)構(gòu)抗原的轉(zhuǎn)基因水稻表達(dá)研究，構(gòu)建了雞新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、CSFV和FMDV等病毒結(jié)構(gòu)抗原的植物表達(dá)質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，陽性轉(zhuǎn)化植株通過篩選和分化，培育成轉(zhuǎn)基因水稻植株，并純化了水稻表達(dá)蛋白.在獲得重組蛋白單體的基礎(chǔ)上，探索開展結(jié)構(gòu)化疫苗的研制，包括嵌合VLP、多聚蛋白體和納米疫苗等，通過自組裝、分子識別或化學(xué)連接制備嵌合VLP，在VLP表面展示多價(jià)抗原；利用氨基、羧基、巰基等不同的功能基團(tuán)通過同源或異源蛋白交聯(lián)或定點(diǎn)、定向連接形成特定結(jié)構(gòu)的多聚蛋白體；將靶抗原與各種納米顆粒偶聯(lián)制備多價(jià)納米疫苗，以期研制“精確、微量、純化、安全、高效”的新概念疫苗，建立新概念疫苗免疫評價(jià)技術(shù)體系，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物疫苗的更新?lián)Q代，構(gòu)建新型疫苗防控技術(shù)體系，為我國動(dòng)物疫病防控提供新的技術(shù)支撐.

圖2 新概念疫苗研制策略Fig.2 New concept of vaccine development strategy

[1] 張改平.新概念疫苗研究[C]//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì). 廣州，2014:5.

[2] 張改平.我國動(dòng)物疫病防控的問題與新概念疫苗研究[C]// 第三屆中國獸醫(yī)臨床大會(huì). 蘭州，2012:3-6.

[3] LEVINE M M, LAGOS R, ESPARZA J. New generation vaccines[M]. 4th ed. Boca Raton: CRC press, 2010.

[4] PLOTKIN S A. Vaccines: the fourth century[J]. Clinical & Vaccine Immunology Cvi, 2009, 16(16):1709-1719.

[5] SERRUTO D, RAPPUOLI R. Post-genomic vaccine development [J].FEBS Lett,2006, 580(12):2985-2992.

[6] KANAMPALLIWAR A, SONI R, GIRDHER A, et al. Reverse vaccinology: basics and applications[J]. Open vaccine journal, 2013, 4(6):1-5.

[7] SEIB K L, ZHAO X, RAPPUOLI R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology[J]. Clinical microbiology & infection the official publication of the European society of clinical microbiology & infectious diseases, 2012, 18 (s5):109-116.

[8] DORMITZER P R, ULMER J B, RAPPUOLI R. Structure-based antigen design: a strategy for next generation vaccines[J]. Trends in biotechnology, 2008, 26(12):659-667.

[9] JARDINE J, JULIEN J P, MENIS S, et al. Rational HIV immunogen design to target specific germline B cell receptors[J]. Science, 2013, 340(6133):711-716.

[10]MCGUIRE A T, DREYER A M, CARBONETTI S, et al. Antigen modification regulates competition of broad and narrow neutralizing HIV antibodies[J].Science,2014, 346(6215):1380-1383.

[11]NUCCITELLI A, COZZI R, GOURLAY L J, et al. Structure-based approach to rationally design a chimeric protein for an effective vaccine against group B Streptococcus infections[J]. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America, 2011, 108(25):10278-10283.

[12]KANEKIYO M, WEI C J, YASSINE H M, et al. Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies[J]. Nature, 2013, 499(7456):102-106.

[13]CORREIA B E, BATES J T, LOOMIS R J, et al. Proof of principle for epitope-focused vaccine design[J]. Nature, 2014, 507(7491):201-206.

[14]LIU H, MOYNIHAN K D, ZHENG Y, et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines[J]. Nature, 2014, 507(7493):519-522.

[15]RAPPUOLI R, PIZZA M, DEL G G, et al. Vaccines, new opportunities for a new society[J]. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America, 2014, 111(34):12288-12293.

[16]WANG X N, ZHANG G P, ZHOU J Y, et al. Identification of neutralizing epitopes on the VP2 protein of infectious bursal disease virus by phage-displayed heptapeptide library screening and synthetic peptide mapping[J]. Viral immunology, 2005, 18(3):549-557.

[17]宋幸輝,王睿,王選年,等. 傳染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原表位多肽P22的免疫原性及生物學(xué)功能鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 42(5):692-697.

[18]張改平,王選年,趙東,等.雞IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位II: CN, ZL200510017450.2[P]. 2007-10-10.

[19]王選年,張改平,李培慶,等.雞IBDV VP2蛋白中和性B細(xì)胞抗原表位II及其應(yīng)用: CN,ZL200510017453.6[P]. 2007-5-9.

[20]王選年,張改平,王三虎,等. 雞IBDV VP3蛋白B細(xì)胞抗原表位I: CN, ZL200510017452.1[P]. 2008-11-12.

[21]王選年,張改平,李培慶,等. 雞IBDV VP2蛋白中和性B細(xì)胞抗原表位III及其應(yīng)用: CN, ZL200710096250.X[P]. 2010-8-25.

[22]JIANG D, LIU Y, WANG A, et al. High level soluble expression and one-step purification of IBDV VP2 protein inEscherichiacoli[J]. Biotechnology letters, 2016, 38(6):901-908.

(責(zé)任編輯：王浩毅)

Animal Immune Potential and New Concept Vaccine

ZHANG Gaiping

(CollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China)

Currently, vaccine research has been changed from conventional vaccinology, including preparation of conventional vaccines and genetically engineered vaccines by using microbial culture techniques and genetic engineering technique, to reverse vaccinology and structural vaccinology, including development of molecular vaccines and structural vaccines using genomics, proteomics and structural biology. In view of the prominent problem of animal immune stress, the new concept of animal immune potential was put forward. The theory system of new concept vaccine was established.And it was committed to the research of new concept vaccine of animal disease.

animal disease; immune potential; new concept vaccine

2017-04-26

國家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(31490601)；河南省重大科技專項(xiàng)(141100110100).

張改平(1960—)，男，河南內(nèi)黃人，中國工程院院士，教授，主要從事分子免疫學(xué)研究，E-mail: zhanggaiping2003@163.com.

S858

A

1671-6841(2017)03-0123-04

10.13705/j.issn.1671-6841.2017140