林瑯 黎紅華 武強(qiáng) 駱文靜

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血管生成對(duì)慢性低灌注狀態(tài)下血腦屏障及腦白質(zhì)損害的影響

林瑯 黎紅華 武強(qiáng) 駱文靜

目的 了解腦血管生成是否參與腦白質(zhì)區(qū)域慢性低灌注狀態(tài)下血腦屏障的破壞機(jī)制。方法 將72只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、腦缺血組、干預(yù)組，腦缺血組及干預(yù)組大鼠結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈構(gòu)建慢性低灌注模型，干預(yù)組給予血管生成抑制劑灌胃以抑制血管生成；對(duì)各組大鼠在相同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)腦深部白質(zhì)區(qū)域微血管密度、白質(zhì)纖維密度以及伊文思藍(lán)靜脈注射6 h后腦白質(zhì)區(qū)域組織內(nèi)伊文思藍(lán)水平。結(jié)果 腦缺血組及干預(yù)組大鼠腦白質(zhì)區(qū)域血管密度和伊文思藍(lán)濃度均顯著高于假手術(shù)組，白質(zhì)纖維密度顯著低于假手術(shù)組，干預(yù)組微血管密度、白質(zhì)纖維密度及腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)水平顯著低于腦缺血組。結(jié)論 慢性低灌注誘導(dǎo)的血管生成可能導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，但血管生成有助于減輕白質(zhì)損傷，但這種保護(hù)作用大于血腦屏障通透性改變帶來(lái)的不利影響。

腦缺血 血腦屏障 血管生成 白質(zhì)損害

慢性低灌注狀態(tài)被認(rèn)為是引起腦白質(zhì)損害、血管性癡呆的原因之一[1-2]。有研究表明慢性低灌注狀態(tài)下血腦屏障破壞可能參與腦組織損傷機(jī)制[3-4]。研究表明，血管生成(angiogenesis)可導(dǎo)致血腦屏障破壞，而缺血、缺氧則是誘導(dǎo)血管生成的重要因素[5]。我們此前的研究也表明，在慢性低灌注狀態(tài)下白質(zhì)區(qū)域的血管生成水平上調(diào)，血腦屏障發(fā)生破壞[6]，提示血管生成所引起的血腦屏障破壞可能為缺血性腦白質(zhì)損害的發(fā)病機(jī)制之一。本研究目的在于闡明抑制慢性低灌注狀態(tài)所致血管生成是否可起到保護(hù)血腦屏障，減輕腦白質(zhì)損害的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)Wistar大鼠72只，體重250～300 g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.2 主要試劑與儀器 索拉菲尼(sorafenib，由德國(guó)拜耳公司提供)，熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記葡聚糖、Luxol固藍(lán)、焦油紫(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)，伊文思藍(lán)、三氯乙酸、碳酸鋰(購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司)，VT1000S腦組織振動(dòng)切片機(jī)(購(gòu)于德國(guó)Leica公司)，C1-SI激光掃描共聚焦顯微鏡(購(gòu)于日本Nikon公司)，RF-540熒光分光光度計(jì)(購(gòu)于日本Shimadzu公司)。

1.3 大鼠分組及干預(yù) 將72只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦缺血組、干預(yù)組各24只，每組大鼠根據(jù)檢測(cè)內(nèi)容分為血管密度亞組、白質(zhì)纖維密度及血腦屏障亞組各8只。將大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸正中切口切開(kāi)皮膚，剝離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌與胸鎖乳突肌，暴露頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈，并分離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)。腦缺血組與干預(yù)組結(jié)扎頸總動(dòng)脈，假手術(shù)組不結(jié)扎，縫合皮膚。術(shù)后3組大鼠同條件飼養(yǎng)，干預(yù)組大鼠每日予血管生成抑制劑-索拉菲尼混懸液2 mg·kg-1·d-1灌胃，假手術(shù)組及腦缺血組大鼠每日予生理鹽水1 mL灌胃。術(shù)后第30 d將大鼠根據(jù)不同檢測(cè)目的分別按下述方法處理。

1.4 血管密度檢測(cè) 大鼠處死前予熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記葡聚糖50 mg靜脈注射，1 h后迅速斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液內(nèi)保存24 h后取前囟前2-4 mm區(qū)域腦組織振動(dòng)切片機(jī)冠狀位切片，片厚100 um。按Paxinos和Watson《大鼠腦立體定位圖譜》確定腦深部白質(zhì)區(qū)域，激光掃描共聚焦顯微鏡下對(duì)腦深部白質(zhì)取600 μm×600 μm區(qū)域行逐層掃描，每層間隔1 μm，共掃描50層。將掃描圖像導(dǎo)入3D Doctor 3.5圖像分析軟件，利用該軟件對(duì)腦血管進(jìn)行三維重建并計(jì)算三維空間內(nèi)血管容積，將血管容積除以三維空間總?cè)莘e得到血管密度。

1.5 Kluver-Barrera髓鞘染色 大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，開(kāi)胸，剪開(kāi)右心耳后經(jīng)左心室快速灌注4%多聚甲醛溶液250 mL，斷頭取腦；腦組織于4%多聚甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋，取前囟后2～4 mm處腦組織冠狀位4 μm切片；每只大鼠取3張切片，將切片脫蠟水化至95%酒精，0.2% Luxol固藍(lán)溶液60 ℃過(guò)夜，95%酒精沖洗后蒸餾水洗，0.05%碳酸鋰溶液30 s，70%酒精洗，0.1%焦油紫溶液1 min，70%酒精洗，脫水、透明、封片。用Image pro plus 6.0軟件分析深部白質(zhì)纖維密度。

1.6 血腦屏障破壞檢測(cè) 大鼠處死前予2%伊文思藍(lán)4 mL/kg靜脈注射，6 h后經(jīng)左心室予0.9%氯化鈉注射液500 mL快速灌注，斷頭取腦，取前囟后2～4 mm處腦組織，稱重后置入1 mL 50%三氯乙酸溶液內(nèi)，經(jīng)勻漿、離心后上清液予3 mL無(wú)水乙醇稀釋，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)620 nm，釋放波長(zhǎng)680 nm)，根據(jù)預(yù)先測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定伊文思藍(lán)水平并計(jì)算腦組織內(nèi)伊文思藍(lán)水平。

2 結(jié) 果

2.1 血管密度測(cè)定 腦缺血組及干預(yù)組血管密度均較假手術(shù)組增高(P<0.05)；干預(yù)組血管密度較腦缺血組減低(P<0.05)(表1、圖1～3)。

2.2 腦深部白質(zhì)纖維改變情況 假手術(shù)組深部白質(zhì)纖維排列致密，走行一致，無(wú)脫髓鞘現(xiàn)象(圖4)；腦缺血組及干預(yù)組大鼠深部白質(zhì)纖維排列松散，走行較紊亂，有較多空泡，脫髓鞘現(xiàn)象明顯(圖5～6)。腦缺血組和干預(yù)組深部白質(zhì)纖維密度均較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)，干預(yù)組深部白質(zhì)纖維密度較缺血組降低(P<0.05)(表1)。

2.3 血腦屏障破壞檢測(cè) 腦缺血組及干預(yù)組伊文思藍(lán)水平均較假手術(shù)組顯著增高(P<0.01)，干預(yù)組大鼠伊文思藍(lán)水平較腦缺血組降低(P<0.05)(表1)。

表1 3組大鼠相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)比較)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01，▲P<0.05；與腦缺血組比較，△P<0.05

3 討 論

腦白質(zhì)疏松是血管性認(rèn)知功能損害的重要病理表現(xiàn)之一，白質(zhì)疏松的嚴(yán)重程度和認(rèn)知功能惡化相關(guān)。許多研究表明白質(zhì)疏松和不完全性缺血(低灌注狀態(tài))有密切聯(lián)系[7]。目前對(duì)缺血性腦白質(zhì)損害的機(jī)制尚未取得共識(shí)，但已有的研究提示血腦屏障破壞可能是缺血性腦白質(zhì)損害的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[8]。Binswanger病患者腦白質(zhì)血腦屏障通透性增高多發(fā)生于白質(zhì)損害區(qū)域邊緣部位，提示血腦屏障破壞可能是白質(zhì)損害的基礎(chǔ)之一[9]。

圖1 假手術(shù)組血管密度正常 圖2 腦缺血組血管網(wǎng)密度明顯增加,走行較紊亂 圖3 干預(yù)組血管網(wǎng)密度有所增加(標(biāo)尺=50μm) 圖4 假手術(shù)組大鼠深部白質(zhì)纖維排列致密,走行一致,無(wú)脫髓鞘現(xiàn)象 圖5 腦缺血組 圖6 干預(yù)組

血管生成(angiogenesis)在缺血性血腦屏障破壞的發(fā)生機(jī)制中有重要地位。大量研究表明，血管生成過(guò)程中的許多重要因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等均可顯著升高腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性[10]。VEGF不僅和缺血狀態(tài)下血腦屏障破壞有關(guān)，還和炎癥等病理狀態(tài)下的血腦屏障破壞相關(guān)[11]，這可能提示在這些病理狀態(tài)下血腦屏障的破壞有著共同的發(fā)病環(huán)節(jié)。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶也與急性腦缺血損害時(shí)血腦屏障的破壞有密切聯(lián)系[12]。缺血、缺氧是引起血管生成的主要始動(dòng)因素，因此慢性低灌注狀態(tài)下血管生成水平很可能被上調(diào)，從而成為慢性低灌注狀態(tài)下血腦屏障破壞的機(jī)制之一。

自被發(fā)明以來(lái)大鼠雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎模型被驗(yàn)證為一種成熟可靠的腦慢性低灌注模型并得到廣泛應(yīng)用。多項(xiàng)研究證實(shí)在雙側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎所致的慢性低灌注情況下大鼠腦白質(zhì)會(huì)發(fā)生明顯的脫髓鞘情況。本研究缺血組腦白質(zhì)纖維密度較假手術(shù)組降低，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。我們此前的研究也已表明，在慢性低灌注狀態(tài)下大鼠腦內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)增多，血管生成水平上調(diào)，血腦屏障發(fā)生破壞[6]，這在本研究中同樣得到了體現(xiàn)。

本研究采用了索拉菲尼(sorafenib)作為血管生成抑制劑，索拉菲尼是一種小分子VEGF受體抑制劑，可通過(guò)抑制VEGF受體而產(chǎn)生抗血管生成作用[13]。給予索拉菲尼后慢性腦缺血大鼠的血管生成水平下調(diào)，血腦屏障通透性下降，從而進(jìn)一步證實(shí)慢性低灌注狀態(tài)下血管生成可以提高血腦屏障通透性。但給予抑制血管生成劑的大鼠的腦白質(zhì)損害較缺血組加重，表明抑制血管生成所得到的血腦屏障通透性下降并沒(méi)有起到減輕腦白質(zhì)損害的效果。這是因?yàn)檠苌煽赡軐?duì)大鼠的腦白質(zhì)損害存在多重作用機(jī)制，一方面它帶來(lái)的血腦屏障破壞可能參與腦白質(zhì)損害的發(fā)生；另一方面血管生成可能使局部血供改善，從而起到保護(hù)白質(zhì)纖維的作用；相比之下，血管生成對(duì)腦白質(zhì)的保護(hù)作用大于其帶來(lái)的損害效應(yīng)。因此，在保護(hù)腦低灌注區(qū)域的血管生成同時(shí)抑制其帶來(lái)的血腦屏障的不利影響可能會(huì)有助于減輕低灌注狀態(tài)下的腦白質(zhì)損害。

盡管本研究預(yù)期通過(guò)抑制血管生成所導(dǎo)致的血腦屏障破壞，從而減輕腦缺血狀態(tài)下腦白質(zhì)損害的目標(biāo)未能實(shí)現(xiàn)，但本研究的結(jié)果進(jìn)一步闡明了慢性低灌注下血管生成和血腦屏障破壞間的聯(lián)系以及血管生成對(duì)缺血性腦白質(zhì)損害的保護(hù)價(jià)值。這對(duì)于進(jìn)一步探索血管生成對(duì)缺血性腦白質(zhì)損害保護(hù)作用機(jī)制以及保護(hù)血腦屏障對(duì)于缺血性腦白質(zhì)損害的價(jià)值有提示意義。

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(2016-10-16收稿)

The effect of angiogenesis on blood-brain barrier disruption and white matter damage under chronic cerebral hypoperfusion status

Lin Lang, Li Honghua, Wu Qiang, et al.

Department of Neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Army, Wuhan 430070

Objective To estimate the influence of angiogenesis on blood-brain barrier damage mechanism under chronic cerebral hypoperfusion status of white matter.Methods Seventy-two male Wistar rats(250-350 g) were divided into three groups: sham-control group, ischemia group and anti-angiogenesis group. Permanent and bilateral common carotid artery occlusion was used to induce hypoperfusion of forebrain in the ischemia group and anti-angiogenesis group, and oral gavage with souvenir was used for anti-angiogenesis administration. Capillary density, Kluver-Barrera's myelin sheath staining and quantitative measurement of Evans Blue were made at the 30th day after the operation.Results Compare to the sham-control group, the ischemia group and anti-angiogenesis group had higher capillary density, higher concentration of Evans Blue and lower density of white matter fibers. The capillary density, the concentration of Evans Blue and the density of white matter fibers in the anti-angiogenesis group were much lower than those in the ischemia group.Conclusion The angiogenesis induced by chronic cerebral hypoperfusion states could lead to blood-brain barrier disruption. However, the protective effect of angiogenesis on white matter overwhelmed the bypass adverse effect of subsequent blood-brain barrier disruption.

Brain ischemia Blood-brain barrier Angiogenesis White matter impairment

430070 武漢，廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

R743.3

A

1007-0478(2017)03-0181-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.03.003