林澤苗 鐘佳賢 賈歡歡 吳玉娥 陳珺 曹祺 曹克廣 李青南，*

1. 廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣東 廣州 510663

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于卵巢功能衰退，血內(nèi)雌激素水平下降，致使骨吸收與骨形成加速，從而造成高轉(zhuǎn)換型骨量丟失，結(jié)果導(dǎo)致骨小梁斷裂、穿孔，皮質(zhì)骨變薄，易于發(fā)生骨折的一種疾病[1-2]。去卵巢大鼠的雌激素水平下降，與人類(lèi)絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松相似。

中藥復(fù)方護(hù)骨膠囊為廣東安諾藥業(yè)股份有限公司的產(chǎn)品，由制何首烏、淫羊藿、熟地黃、龜甲、骨碎補(bǔ)、杜仲、續(xù)斷、巴戟天、當(dāng)歸和山藥等中藥根據(jù)中醫(yī)的君臣佐使原則組成。目前在臨床已廣泛應(yīng)用于治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。為深入探討其作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)采用護(hù)骨膠囊作用于去卵巢大鼠，觀察大鼠血清中與鈣代謝直接相關(guān)的激素和性激素及子宮的影響，以進(jìn)一步闡明其預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)環(huán)境

3月齡SPF級(jí)雌性 SD大鼠60只，體重(210±3)g (由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：NO.44007200017783)。飼養(yǎng)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，室溫為(25±2)℃，濕度為(60±2)%。任意進(jìn)食大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水。

1.2 動(dòng)物分組與造模

按隨機(jī)函數(shù)將大鼠分為6組：假手術(shù)組(Sham)；去卵巢組(OVX)；仙靈骨葆膠囊組(Pos)；護(hù)骨膠囊低劑量組(HG-L)；護(hù)骨膠囊中劑量組(HG-M)；護(hù)骨膠囊高劑量組(HG-H)。每組各10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)2w后,用2%戊巴比妥鈉，按45mg/kg 腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，大鼠成功麻醉后，行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。假手術(shù)組按同法操作，僅摘除雙側(cè)卵巢周?chē)糠种尽?/p>

1.3 藥物及給藥方法

護(hù)骨膠囊由制何首烏、淫羊藿、熟地黃、龜甲、巴戟天、杜仲、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、當(dāng)歸和山藥組成，由廣東安諾藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)為藥準(zhǔn)字Z20040124，批號(hào)為20150101，規(guī)格為0.45 g；仙靈骨葆膠囊(陽(yáng)性藥物)由淫羊藿、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、知母、丹參和地黃組成，由貴州同濟(jì)堂制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025337，批號(hào)為20140701，規(guī)格為0.50 g。仙靈骨葆膠囊組每天灌服人體等效劑量的仙靈骨葆膠囊0.270 g/(kg·10ml)。護(hù)骨膠囊低、中、高劑量組每天分別灌服0.243 g/(kg·10ml)、0.486 g/(kg·10ml)、0.972 g/(kg·10ml)。其中護(hù)骨膠囊中劑量組為人體等效劑量組。

1.4 主要試劑及儀器

試劑：石蠟、二甲苯、無(wú)水乙醇、鹽酸乙醇、TO生物型制片透明劑、蘇木精液、伊紅液、中性樹(shù)膠。儀器：Leica包埋機(jī)、Leica切片機(jī)、Leica碳化鎢鋼刀、Leica生物顯微鏡。

1.5 血清性激素的檢測(cè)

藥物干預(yù)結(jié)束時(shí)，心臟取血處死大鼠，將血液以3000 r/min離心20 min，分離出血清，送至上海邦奕生物科技有限公司，采用Elisa試劑盒檢測(cè)血清激素5項(xiàng)：1, 25雙羥維生素D3(1,25(OH)2D3)、甲狀旁腺激素(PTH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)。

1.6 子宮觀察

藥物干預(yù)結(jié)束時(shí)，心臟取血處死大鼠，取各組大鼠子宮，稱(chēng)重后，進(jìn)行石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 OVX及HG對(duì)大鼠血清PTH和1,25(OH)2D3的影響

與Sham組比較，OVX組的PTH水平顯著升高(P<0.01)；與OVX組相比，PTH水平在HG-L、HG-M(P<0.01)和HG-H組(P<0.05)減少，HG-H組比HG-L、HG-M組顯著升高，Pos組與OVX組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HG各組均比Pos組降低(P<0.01、P<0.05)。1,25(OH)2D3在此實(shí)驗(yàn)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)后血清激素指標(biāo)的變化±s，ng/L)Table 1 Changes of serum hormone indexes in rats after ±s，ng/L)

Note:*,**P<0.05,0.01 VS Sham;#,##P<0.05 VS OVX;△，△△P<0.05,0.01 VS Pos;□，□□P<0.05,0.01 VS HG-L;◇，◇◇P<0.05,0.01 VS HG-M.

2.2 OVX及HG對(duì)大鼠血清E2、P和T的影響

與Sham組相比，OVX組的E2水平和P水平下降(P<0.01，P<0.05)，T水平升高(P<0.05)。與OVX組相比，E2水平在HG-L和HG-M組增加(P<0.01)，HG-H組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但HG-H組較HG-L、HG-M組下降(P<0.05)。Pos組與OVX組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HG-L和HG-M組的E2較Pos顯著升高；P水平在Pos組顯著性升高(P<0.01)，在HG-L組減少(P<0.05)，HG-M組和HG-H組無(wú)變化。T水平在HG-L組和HG-H組無(wú)變化，HG-M組減少(P<0.01)，在Pos組顯著性升高(P<0.01)。見(jiàn)表2。

2.3 OVX及HG對(duì)大鼠子宮的影響

Sham組、OVX組、Pos組、HG-L組、HG-M組、HG-H組的子宮重量分別是(0.670±0.19)g、(0.103±0.04)g、(0.097±0.02)g、(0.113±0.04)g、(0.112±0.02)g、(0.114±0.06)g。其中，與Sham組比較，各組的子宮重量均顯著減少(P<0.01)。藥物組的子宮重量與OVX組比無(wú)變化。

表2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)后血清性激素指標(biāo)的變化±s)Table 2 Changes of serum sex hormone indexes in rats after the experiment(±s)

Note:*,**P<0.05,0.01 VS Sham;#,##P<0.05,0.01 VS OVX;△，△△P<0.05,0.01 VS Pos;□，□□P<0.05,0.01 VS HG-L;◇，◇◇P<0.05,0.01 VS HG-M.

Sham組的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞肥厚，腔大，無(wú)明顯增厚及增生；與Sham組比較，OVX組子宮萎縮變小，宮腔變小，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞萎縮；與OVX組比較，HG-L和HG-M組無(wú)明顯差異，HG-H組內(nèi)膜稍增厚。Pos組無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)后子宮切片(HE染色)。A：假手術(shù)組(5×)；B：去卵巢組(5×)；C：仙靈骨葆膠囊組(5×)；D：護(hù)骨膠囊低劑量組(5×)；E：護(hù)骨膠囊低中量組(5×)；F：護(hù)骨膠囊低高量組(5×)Fig.1 The rats uterus slices after the experiment(HE dyeing). A: Sham(5×);B:OVX(5×);C: Pos(5×);D:HG-L(5×);E:HG-M(5×);F:HG-H(5×)

3 討論

3.1 血清PTH和1,25(OH)2D3分析

PTH和1,25(OH)2D3是調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣、磷系統(tǒng)平衡的兩大主要激素[3-4]。本實(shí)驗(yàn)OVX組PTH水平升高，可能是因?yàn)榇笫笕ヂ殉埠?，E2水平下降所導(dǎo)致。研究表明[5]，E2分泌下降，會(huì)使骨骼中的鈣結(jié)合力降低，刺激PTH的分泌，PTH激發(fā)升高，作用于骨組織，使間質(zhì)細(xì)胞向破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)破骨細(xì)胞吸收，使骨鈣釋放入血，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[6]。而HG各劑量組的PTH水平顯著降低，這與補(bǔ)腎化瘀壯骨湯[7]、鹿銜草[8]等對(duì)去卵巢大鼠的研究結(jié)果一致。提示護(hù)骨膠囊能調(diào)節(jié)去卵巢后的PTH分泌失常。Pos組的PTH水平與OVX組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明仙靈骨葆膠囊不調(diào)節(jié)PTH，這與趙小梅[9]對(duì)仙靈骨葆膠囊的研究一致。而實(shí)驗(yàn)各組的1,25(OH)2D3差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果說(shuō)明OVX與藥物不是通過(guò)血清中的1,25(OH)2D3起作用的。

3.2 血清E2、P和T分析

E2主要由卵巢、黃體和胎盤(pán)產(chǎn)生，肝、腎上腺皮質(zhì)及乳房等也能產(chǎn)生少量E2，它是影響雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育，維持雌性性機(jī)能的重要類(lèi)固醇激素[10]。當(dāng)雌激素缺乏時(shí)會(huì)引起明顯的骨量丟失，骨結(jié)構(gòu)退變以及骨高轉(zhuǎn)換等骨質(zhì)疏松癥狀[11]。本實(shí)驗(yàn)中，OVX組E2水平顯著降低，HG-L和HG-M組則顯著升高，HG-H組E2水平也升高，但與OVX組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明護(hù)骨膠囊具有補(bǔ)充性激素的作用，能調(diào)節(jié)去卵巢造成的E2分泌下降，這可能是因?yàn)樽o(hù)骨膠囊藥物組成里的淫羊藿、制何首烏和骨碎補(bǔ)等補(bǔ)腎中藥含有植物雌激素。植物雌激素的研究已越來(lái)越受到重視。劉仕杰等[12]發(fā)現(xiàn)淫羊藿可提高OVX大鼠血清雌激素水平。楊利娟[13]通過(guò)雌激素受體(ERα/β)對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，證明了何首烏的主要活性成分大黃素、骨碎補(bǔ)中的柚皮苷和淫羊藿中的淫羊藿苷都具有顯著的植物雌激素作用，說(shuō)明護(hù)骨膠囊能產(chǎn)生植物雌激素樣作用。Pos組的E2水平與OVX組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明仙靈骨葆膠囊不調(diào)節(jié)血清E2。這與趙小梅[9]對(duì)仙靈骨葆膠囊的研究結(jié)果一致。

P是重要的甾體激素，主要在卵巢黃體的顆粒細(xì)胞、胎盤(pán)的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞合成[14]。研究發(fā)現(xiàn)P能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞TGF-β1、TGF-β2的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化、增強(qiáng)成骨功能及骨基質(zhì)合成，促進(jìn)骨形成[15]。本研究OVX組P水平降低，這與羅曉冰等[16]對(duì)OVX大鼠的研究結(jié)果一致。服用護(hù)骨膠囊后，大鼠血清P水平不升高，這可能是因?yàn)镋2能與P競(jìng)爭(zhēng)性激素結(jié)合球蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)，故游離的E2水平升高，P不升高[17]。Pos組P水平顯著升高，提示仙靈骨葆膠囊通過(guò)P促進(jìn)成骨的作用。

T具有促進(jìn)骨形成與鈣磷沉積的作用，可直接作用于成骨細(xì)胞，還可通過(guò)轉(zhuǎn)化為E2間接起作用[18]。P、T和E2均為甾體激素，在體內(nèi)可以通過(guò)中間體雄烯二酮進(jìn)行P→T→E2的轉(zhuǎn)化[19]。研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后婦女E2主要來(lái)自于腎上腺皮質(zhì)分泌的T在體內(nèi)的轉(zhuǎn)變[20]。故OVX組T升高，可能是由于去卵巢后E2下降，刺激T分泌。與OVX組比，T水平在HG-L和HG-H組無(wú)變化；在HG-M組降低，但與Sham組水平相當(dāng)，具體原因有待深入研究；仙靈骨葆膠囊的T水平在OVX組的基礎(chǔ)上顯著升高。有研究表明：T既能增加骨細(xì)胞的增生、分化，又能增加堿性磷酸酶的活性而起成骨作用[21]。本研究的結(jié)果說(shuō)明仙靈骨葆膠囊通過(guò)T促進(jìn)成骨的作用。

3.3 OVX及HG對(duì)大鼠子宮的影響

大鼠切除卵巢后，子宮明顯萎縮。卵巢的功能之一是分泌雌激素，維持子宮功能，雌激素與孕激素等共同作用于子宮內(nèi)膜[22]。故大鼠切除卵巢后，OVX組E2減少，子宮內(nèi)膜變薄，子宮萎縮變小，提示造模成功。護(hù)骨膠囊能顯著增加血清E2水平，但子宮與OVX組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅高劑量使子宮內(nèi)膜稍增加。其原因可能是護(hù)骨膠囊含有的成分為植物雌激素，對(duì)子宮的影響很小。這與西藥雌激素的作用不同，研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期補(bǔ)充外源性的西藥雌激素，易導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生，水鈉潴留，嚴(yán)重的還會(huì)出現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、血栓栓塞等不良反應(yīng)[23]。

綜上所述，護(hù)骨膠囊能降低去卵巢大鼠血清的PTH水平，升高E2水平，說(shuō)明護(hù)骨膠囊能調(diào)節(jié)與鈣代謝直接相關(guān)的激素，同時(shí)又具有調(diào)節(jié)和補(bǔ)充雌激素的作用，且對(duì)子宮影響不大。該研究提示護(hù)骨膠囊對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的治療機(jī)理可能是通過(guò)調(diào)節(jié)血清中的 PTH和E2的水平，為推廣護(hù)骨膠囊臨床防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。