楊敏 蔣紅櫻 何振坤 曾怡 白彝華* 陳良敬

1. 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，云南 昆明 650101 2. 溫州市中心醫(yī)院外科，浙江 溫州 325000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減低和骨微結(jié)構(gòu)退化導(dǎo)致骨脆性增加,骨折風(fēng)險性增加為特征的一種疾病[1]。絕經(jīng)后OP是骨質(zhì)疏松癥中最常見類型，與雌激素缺乏有關(guān)，并且約有 40%-50% 的50歲以上婦女可能發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折[2]，嚴(yán)重影響絕經(jīng)后女性健康。目前尚無有效的方法再生已經(jīng)丟失的骨小梁，因此，有效地延緩骨量減少速度，對預(yù)防絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥和脆性骨折意義重大。ω-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)來源于深海冷水魚類(如鮭魚、鯖魚、蹲魚、金槍魚等)，安全無毒，主要成員有二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)，目前在臨床方面主要用于降脂、抗凝、免疫營養(yǎng)支持和抗炎等[3]。近期有研究表明，骨代謝[4]、骨質(zhì)疏松[5]與ω-3 PUFA關(guān)系密切。骨強(qiáng)度取決于骨密度和骨質(zhì)量，骨強(qiáng)度下降是OP的根本特點(diǎn)。但是骨密度僅反映了骨強(qiáng)度的70%[1]，并不能體現(xiàn)骨微結(jié)構(gòu)，而后者是骨脆性的決定因素，可獨(dú)立于骨密度而起作用[6]。目前的研究多限于ω-3 PUFA對骨密度及生物力學(xué)指標(biāo)的影響[7,8]，有關(guān)ω-3 PUFA對骨微結(jié)構(gòu)影響的研究極少。因此，本研究擬以去勢雌性大鼠為研究對象，觀察ω-3 PUFA對去勢大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響，為更好地防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供一定的實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF級11 w齡雌性大鼠30只，體重250±25 g，實(shí)驗(yàn)動物由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(滬)2006-0010；動物使用許可證號：SXK(滬)2006-0010。整個實(shí)驗(yàn)中，所有大鼠自由進(jìn)食和飲水，使用標(biāo)準(zhǔn)飼料，其中鈣含量為1.33%，磷含量為0.95%。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為25±2℃，相對濕度50%～70%，12 h晝夜循環(huán)周期。ω-3 PUFA采用多烯酸乙酯膠丸，每粒含EPA乙酯和DHA乙酯(0.25g/丸)。國藥準(zhǔn)字H20003082，由廈門魚肝油廠制造，產(chǎn)品批號為11354001。雌二醇(E2)試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所。

1.2 分組及模型構(gòu)建

所有雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組3組，每組10只。假手術(shù)組僅切除卵巢周圍脂肪組織(卵巢大小)，其余兩組切除雙側(cè)卵巢。

1.3 實(shí)驗(yàn)干預(yù)

術(shù)后恢復(fù)2 w開始干預(yù)。模型組和假手術(shù)組給予生理鹽水灌胃，量為1 mL/(100 g·d)，實(shí)驗(yàn)組給予ω-3 PUFA，量為150 mg/(kg·d)，此劑量可改善生物力學(xué)性能、改善骨質(zhì)高轉(zhuǎn)換狀態(tài)[8,9]。ω-3 PUFA與生理鹽水混合，按照1 mL/(100g·d)的量灌胃，干預(yù)12 w。每周稱量1次空腹體重，按體重調(diào)整用藥量。

1.4 指標(biāo)檢測

干預(yù)12 w后，處死所有大鼠，經(jīng)下腔靜脈采血，4℃離心分離血清用于檢測血鈣、磷、堿性磷酸酶(ALP)和雌激素水平。鈣、磷、ALP應(yīng)用日本日立7080全自動生化分析儀測定。雌二醇采用放射免疫法測定，嚴(yán)格按使用說明操作。完整分離右側(cè)整段股骨，剔除肌肉組織，10%甲醛固定液固定24 h，轉(zhuǎn)75%乙醇過夜，應(yīng)用micro-CT檢測骨密度和骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)，后者包括松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)(骨小梁體積比率(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.n)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁間隙(Tb.sp)和皮質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)(皮質(zhì)體積比率(BV/TV)、皮質(zhì)厚度(Cor·Th)和皮質(zhì)骨的孔隙率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS16.0做統(tǒng)計(jì)分析，連續(xù)變量用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在滿足總體方差齊性、樣本獨(dú)立及正態(tài)分布的前提下，按照one-way ANOVA的方法對總體均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩兩比較采用SNK法。所有的檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)過程中，假手術(shù)組1只大鼠因術(shù)后感染死亡，模型組1只大鼠因麻醉藥誤入下腔靜脈死亡，其余大鼠術(shù)后恢復(fù)及生活狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，各組大鼠總數(shù)為假手術(shù)組9只，模型組9只，實(shí)驗(yàn)組10只。

2.2 各組之間骨代謝指標(biāo)和E2比較

各組大鼠血清鈣、磷無顯著性差異。模型組、實(shí)驗(yàn)組ALP水平均顯著高于假手術(shù)組，見表1。E2在3組之間存在顯著差異，表現(xiàn)為模型組水平最低，而假手術(shù)組水平最高，見表1。

表1 3組大鼠骨代謝指標(biāo)和雌二醇比較±s)Table 1 Comparison of bone metabolism indexes and estradiol levels among three groups (±s)

注：ALP：堿性磷酸酶；與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

Note:ALP:alkaline phosphatase; compared with Sham operation group，aP<0.05; compared with model，bP<0.05

2.3 ω-3PUFA對松質(zhì)骨骨密度和骨微結(jié)構(gòu)的影響

實(shí)驗(yàn)組松質(zhì)骨骨密度、BV/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著低于假手術(shù)組，而Tb.Sp顯著高于假手術(shù)組；實(shí)驗(yàn)組松質(zhì)骨骨密度、BV/TV、Tb.Th和Tb.N均顯著高于模型組，而Tb.Sp顯著低于模型組，見表2。

表2 3組大鼠松質(zhì)骨骨密度及骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較±s)Table 2 Comparison of bone mineral density and microstructure of cancellous bone among three groups(±s)

注：BV/TV：骨小梁體積比率；Tb.Th：骨小梁厚度；Tb.N：骨小梁數(shù)目；Tb.Sp：骨小梁間隙；與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

Note:BV/TV:Trabecular bone volume ratio; Tb.N:trabecular number;aP<0.05,compared with Sham operation group;bP<0.05,compared with model

2.4 ω-3PUFA對皮質(zhì)骨骨密度和骨微結(jié)構(gòu)的影響

實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)骨骨密度、BV/TV和Cr.Th均顯著低于假手術(shù)組，而孔隙率顯著高于假手術(shù)組；實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)骨骨密度、BV/TV和Cr.Th均顯著高于模型組，而孔隙率顯著低于模型組，見表3。

表3 3組大鼠皮質(zhì)骨骨密度及骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較±s)Table 3 Comparison of bone mineral density and bone microstructure among three groups(±s)

注：BV/TV：骨皮質(zhì)體積比率；Cr.Th：皮質(zhì)厚度；與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05

Note:BV/TV:Trabecular bone volume ratio; Cr.Th:cortical thickness;aP<0.05,compared with Sham operation group;bP<0.05,compared with model

3 討論

絕經(jīng)后雌激素水平降低，雌激素的缺乏破壞了骨吸收和骨形成的平衡，導(dǎo)致骨吸收速度超過骨形成速度，因此絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥屬于高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松。在本研究中，血清鈣磷水平無差異，而模型組的ALP水平顯著升高，提示骨形成增加，符合絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的機(jī)制[1]。隨著對骨質(zhì)疏松機(jī)制認(rèn)識的加深，治療骨質(zhì)疏松癥的藥物研究也在不斷深入和完善。ω-3PUFA屬長鏈不飽和脂肪酸，目前在臨床方面主要用于降脂、抗凝、免疫營養(yǎng)支持和抗炎等[3]。近期有ω-3PUFA治療骨質(zhì)疏松的報(bào)道，但是多從骨密度和營養(yǎng)的角度分析[7,9]。本實(shí)驗(yàn)以去勢大鼠骨微結(jié)構(gòu)作為切入點(diǎn)，探討ω-3PUFA對骨質(zhì)疏松癥的防治作用。

高分辨率micro-CT是用于實(shí)驗(yàn)室測量末梢骨的超高分辨率CT掃描機(jī)，可顯示橈骨和脛骨的小梁骨結(jié)構(gòu)，并可對骨組織進(jìn)行影像學(xué)三維重建和形態(tài)結(jié)構(gòu)的分析，獲取描述骨內(nèi)部微結(jié)構(gòu)的參數(shù)。micro-CT所測的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)指標(biāo)如骨容積、骨小梁數(shù)目等能夠非常靈敏地反映骨質(zhì)疏松的早期改變，甚至要早于傳統(tǒng)的骨組織計(jì)量學(xué)的相應(yīng)指標(biāo)[6]。本研究即是應(yīng)用該技術(shù)對3組大鼠的股骨進(jìn)行掃描、重構(gòu)和分析，測量其骨密度、皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，無論是松質(zhì)骨還是皮質(zhì)骨，實(shí)驗(yàn)組大鼠的骨量減少較模型組輕，這與近期國內(nèi)外的研究[7,8,10]結(jié)果相似。本研究的一個重要結(jié)果是發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組骨微結(jié)構(gòu)顯著優(yōu)于模型組，從骨微結(jié)構(gòu)的角度證實(shí)ω-3PUFA對于骨質(zhì)疏松的防治作用。通過降低骨量丟失和改善骨微結(jié)構(gòu)，ω-3PUFA可改善骨礦密度和骨質(zhì)量，從而提高骨強(qiáng)度，這對于預(yù)防骨質(zhì)疏松及其最常見并發(fā)癥脆性骨折均具有重要意義。國外已有動物實(shí)驗(yàn)[11]表明，ω-3 PUFA能夠增加蛋雞的骨強(qiáng)度，減少骨折發(fā)生。將來可進(jìn)行臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

ω-3PUFA改善骨礦密度和骨質(zhì)量的確切機(jī)制并不明確。Yao等[10]以去卵巢大鼠為研究對象并體外培養(yǎng)其破骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ω-3PUFA能夠顯著降低其抗酒石酸酸性磷酸酶活性，提示抑制破骨細(xì)胞的產(chǎn)生和活性可能是ω-3PUFA延緩去卵巢大鼠骨丟失的機(jī)制之一。Watkins 等[12]發(fā)現(xiàn)用EPA干預(yù)前成骨細(xì)胞系細(xì)胞MC3T3-E1 48 h后其骨形成標(biāo)記物堿性磷酸酶水平顯著高于花生四烯酸，提示促進(jìn)成骨細(xì)胞作用可能是ω-3PUFA改善骨量和骨微結(jié)構(gòu)的另一機(jī)制。本研究比較了3組大鼠的雌激素水平，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的雌激素水平較模型組有所改善，與錢康[7]的研究結(jié)果相似，提示改善雌激素水平也是ω-3PUFA防止骨質(zhì)疏松的機(jī)制之一。

總之，本研究表明，ω-3 PUFA對去卵巢大鼠的骨微結(jié)構(gòu)有一定的改善作用，這對于防治骨質(zhì)疏松具有一定的意義。