王慧蓮 孟慶良 李松偉 王濟華

1. 河南省中醫(yī)院風(fēng)濕病科，河南 鄭州 450000 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕病科，河南 鄭州 450000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫疾病，主要病理表現(xiàn)為炎癥的反復(fù)發(fā)作、滑膜組織過度增殖和功能異常，最終引起關(guān)節(jié)纖維化和關(guān)節(jié)功能障礙[1]。已經(jīng)證實成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)可表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化細胞的特征，呈類腫瘤細胞樣異常增殖，侵入到軟骨和軟骨下的骨質(zhì)，并產(chǎn)生炎性介質(zhì)、分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等，其過度增殖在RA的發(fā)病過程中起到了重要作用[2-3]。因此，誘導(dǎo)人成纖維樣滑膜細胞的凋亡是治療RA的主要靶點。目前臨床上多采用甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺等抗腫瘤藥物治療RA患者，雖然療效明顯，但都有不良反應(yīng)多或價格昂貴等缺點，增加了患者的痛苦和經(jīng)濟負擔(dān)[4]。本研究從中醫(yī)中藥的角度研究漢黃芩素對人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RA-FLS)凋亡的影響，探討漢黃芩素對RA潛在的治療作用。

1 材料和方法

1.1 樣本與試劑

采集2015年6至12月河南省中醫(yī)院風(fēng)濕科收治的7例RA患者關(guān)節(jié)積液標本，其中男4例、女3例；年齡38～62歲，平均55.7歲。入選標準：確診診斷均符合2010年ACR/EULR分類標準。排除標準：①合并感染者；②伴隨慢性心、肝、腎功能不全者；③合并其他自身免疫性疾病者；④合并冠心病患者；⑤合并血液系統(tǒng)疾病患者。所有患者均簽署知情同意書。體外原代培養(yǎng)人成纖維樣滑膜細胞。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、DCFH-DA和羅丹明123熒光染料購自美國Sigma公司，Annexin V/FITC 細胞凋亡試劑盒和活性氧清除劑(NAC)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，p38MAPK抑制劑 (SB203580)購于美國Calbiochem公司，漢黃芩素購自南京郎澤醫(yī)藥科技有限公司(純度大于98.0%)，p-p38MAPK、p38MAPK及β-actin 的單克隆抗體及辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 成纖維樣滑膜細胞的分離與培養(yǎng)

無菌采集患者關(guān)節(jié)腔積液30 mL，1000 r/min 離心10 min，棄上清后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)重懸沉淀，經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，將濾液以1000 r/min 離心10 min，再以PBS清洗沉淀2次后，用含有10%的胎牛血清及青霉素和鏈霉素各100U的DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞，用計數(shù)板計數(shù)細胞。將收集的細胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。12 h更換一次培養(yǎng)液，去除非貼壁細胞，重復(fù)2～3次。3 d后倒置顯微鏡下觀察，細胞呈梭狀成纖維樣。用胰蛋白酶法收集滑膜細胞，按細胞密度5×105個/L復(fù)種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中。后續(xù)用于實驗的細胞為3～5代生長穩(wěn)定的成纖維樣滑膜細胞。

1.3 細胞處理與分組

將純化培養(yǎng)的成纖維樣滑膜細胞按照1×103個/L接種于平底48孔板中，待細胞生長至80%時進行處理并分組。(1)正常對照組：不加任何藥物處理，常規(guī)培養(yǎng)；(2)低劑量漢黃芩素組：加入漢黃芩素使其終濃度為20 μg/mL；(3)中劑量漢黃芩素組：加入漢黃芩素使其終濃度為50 μg/mL；(4)高劑量漢黃芩素組：加入漢黃芩素使其終濃度為100 μg/mL；(5)100 μg/mL漢黃芩素+ N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)組：細胞先加入終濃度為5 mmol/L活性氧的清除劑NAC處理12 h，然后再加入漢黃芩素，使其終濃度為100 μg/mL；(6)100 μg/mL漢黃芩素+SB203580組：細胞先加入終濃度為10 μmol/L p38MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)抑制劑SB203580處理12 h，再加入漢黃芩素使其終濃度為100 μg/mL。

1.4 MTT法檢測細胞增殖

取待測組對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞濃度以5×104個/mL接種于96孔板中，同時設(shè)定陰性對照孔(即不加細胞按照同步驟處理)，各自培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，室溫振蕩10 min，在酶標儀上檢測490 nm處吸光度[光密度(optical delnsity，OD)值]。每組同時設(shè)置5個重復(fù)孔。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

調(diào)整待測組細胞濃度為1×106個/mL，取200 μL 細胞懸液，F(xiàn)ITC標記的Annexin-V和PI各5 μL 混勻后避光孵育20 min，低速離心收集細胞，150 μL PBS重懸細胞，用流式細胞檢測儀上樣檢測各組成纖維樣滑膜細胞凋亡率。

1.6 細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)含量的測定

Rh123是一種可被線粒體吸收的綠色熒光染料，其吸收值隨細胞MMP的改變而變化，因此本實驗根據(jù)熒光強度來間接反映MMP的高低。將100 μL待測組細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞生長融合至80%時，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入10 μg/L Rh123于37 ℃避光孵育45 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選擇3個不同區(qū)觀察其熒光，并用ImageJ 1.41軟件分析各視野下平均熒光強度，對各組細胞的每個樣本進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.7 細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量的檢測

DCFH-DA能夠自由通過細胞膜，被細胞內(nèi)的ROS氧化成有熒光的DCF，本研究通過觀察DCF的熒光強度分析細胞內(nèi)ROS的水平。將100 μL待測組細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞生長融合至80%時，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入10 μmol/L DCFH-DA于37 ℃避光孵育30 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機選擇3個不同區(qū)觀察其熒光，并用ImageJ 1.41軟件分析各視野下平均熒光強度，對各組細胞的每個樣本進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8 Western blot分析p38MAPK相關(guān)蛋白的表達

收獲待測組細胞，加裂解液提取蛋白，BCA 法進行總蛋白定量。調(diào)整上樣量為25 μg總蛋白/樣本，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉過夜。封閉完畢后PBS 洗膜5次，分別加一抗(所用的一抗稀釋比例分別為p-p38MAPK抗體11000、p38MAPK抗體11000)，37 ℃反應(yīng)1.5 h，PBS洗膜5次，加辣根過氧化物酶標記二抗，37 ℃反應(yīng)1 h，PBS洗膜5次。染色，曝光，采用BIORAD GELDOC XR 凝膠成像系統(tǒng)依次顯影、定影，Quantity One Basic 軟件分析膠片蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)結(jié)果

7例患者的關(guān)節(jié)滑液經(jīng)處理后均成功獲得大量成纖維樣細胞，經(jīng)鑒定該細胞為CD68陰性細胞，即人成纖維樣滑膜細胞。經(jīng)過反復(fù)貼壁與傳代3代后，細胞純度達到90%以上，體外生長穩(wěn)定，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)基本為長梭形，胞質(zhì)透亮、均勻，細胞輪廓清晰，適合后續(xù)實驗(見圖1)。

圖1 光鏡下成纖維樣滑膜細胞形態(tài)觀察(×200)Fig.1 Morphology of RA-FLS under light microscope (×200)

2.2 漢黃芩素抑制RA-FLS細胞增殖

與正常對照組相比，不同濃度漢黃芩素處理后RA-FLS細胞各個時間點在490 nm下OD值均明顯減少，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

2.3 漢黃芩素誘導(dǎo)RA-FLS細胞凋亡

與正常對照組細胞凋亡率(7.69±1.46)%比較，從低劑量到高劑量漢黃芩素處理組細胞凋亡率依次為(12.32±1.65)%、(15.89±2.17)%和(19.16±2.13)%，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

表1 MTT法檢測各組細胞的增殖(OD值，Table 1 Proliferation of RA-FLS in each group detected with MTT assay (OD Value,

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與低劑量漢黃芩素組相比，#P<0.05；與中劑量漢黃芩素組相比，&P<0.05。

圖2 不同濃度漢黃芩素對RA-FLS細胞凋亡的影響Fig.2 The effect of wogonin with different concentrations on the RA-FLS apoptosis

2.4 漢黃芩素降低RA-FLS細胞MMP水平

與正常對照組細胞Rh123的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)(反應(yīng)MMP大小的指標)(43.56±2.45)%相比，從低劑量到高劑量漢黃芩素處理組細胞中Rh123的MFI數(shù)值依次為(38.37±2.31)%、(32.76±2.89)%和(27.98±1.98)%，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

2.5 漢黃芩素增加RA-FLS細胞內(nèi)ROS生成

與正常對照組細胞中DCF的MFI(5.65±0.91)%相比，從低劑量到高劑量漢黃芩素處理組細胞中DCF的MFI數(shù)值依次為(9.28±1.02)%、(12.47±1.24)%和(15.89±1.14)%，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。

2.6 漢黃芩素通過激活p38MAPK信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡

與正常對照組相比，不同劑量漢黃芩素均能夠上調(diào)p-p38MAPK蛋白水平，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系，但并不影響p38MAPK總蛋白水平。與100 μg/mL漢黃芩素組相比，100 μg/mL漢黃芩素+SB203580組中細胞p-p38MAPK蛋白水平明顯降低，同時細胞凋亡也明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖3、4)。

表2 不同劑量漢黃芩素對RA-FLS細胞MMP和ROS水平的影響Table 2 The effect of wogonin with different concentrations on the levels of MMP and ROS in RA-FLS

注：與正常對照組相比，*P<0.05；與低劑量漢黃芩素組相比，#P<0.05；與中劑量漢黃芩素組相比，&P<0.05。

2.7 漢黃芩素通過介導(dǎo)ROS生成而激活p38MAPK信號通路

與100 μg/mL漢黃芩素組相比，100 μg/mL漢黃芩素+NAC組p-p38MAPK蛋白水平顯著降低，同時細胞凋亡率也顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖3、圖4)。

圖3 各組細胞中p38MAPK信號通路中相關(guān)蛋白檢測Fig.3 The protein levels of p38 MAPK in each group detected with Western blotting注：與正常對照組相比，*P<0.05；與低劑量漢黃芩素組相比，#P<0.05；與中劑量漢黃芩素組相比，&P<0.05；與100 μg/mL漢黃芩素組相比，aP<0.05。

圖4 SB203580和NAC對RA-FLS細胞凋亡的影響Fig.4 The effect of SB203580 and NAC on the apoptosis of RA-FLS

3 討論

RA是目前臨床上比較常見的一種自身免疫性疾病，病因復(fù)雜。研究表明人成纖維樣滑膜細胞過度增生和分泌是RA發(fā)病的重要基礎(chǔ)，參與關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞[5]。因此，有效抑制成纖維樣滑膜細胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡能夠為臨床治療RA提供新的靶點和思路。漢黃芩素是從常見中藥黃芩中提取的黃酮類化合物，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤和神經(jīng)保護等作用[6]。已經(jīng)證實漢黃芩素能夠誘導(dǎo)多種細胞的凋亡，例如白血病多藥耐藥細胞株K562/A02細胞和肝癌HepG2細胞[7-8]。本研究探討漢黃芩素對成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響以及可能的作用機制。

本研究中首先分離純化培養(yǎng)RA患者的成纖維樣滑膜細胞，經(jīng)過不同濃度漢黃芩素處理后，MTT實驗和流式細胞術(shù)均證實漢黃芩素能夠明顯抑制成纖維樣滑膜細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。已知細胞凋亡的途徑有多種，其中線粒體損傷介導(dǎo)的凋亡是最常見的凋亡，主要表現(xiàn)為線粒體膜電位的缺失和細胞內(nèi)ROS的生成。本研究在探索漢黃芩素對RA-FLS細胞凋亡機制中發(fā)現(xiàn)，不同劑量漢黃芩素均能夠降低細胞線粒體膜電位，同時增加細胞內(nèi)ROS的生成量，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。這表明漢黃芩素通過誘導(dǎo)線粒體損傷來增加細胞的凋亡。

p38MAPK蛋白是MAPKs蛋白激酶家族的主要成員之一，絲氨酸/酪氨酸殘基可被磷酸化，細胞外多種應(yīng)激原都可引起細胞內(nèi)蛋白激酶的連鎖反應(yīng)，從而影響細胞的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和細胞表面受體表達等生物效應(yīng)，在細胞凋亡中發(fā)揮著舉足輕重的作用[9-10]。已有研究表明細胞內(nèi)ROS生成量的增加誘導(dǎo)的細胞凋亡與p38MAPK信號通路密切相關(guān)[11-12]。本研究中發(fā)現(xiàn)不同劑量漢黃芩素能夠上調(diào)p38MAPK磷酸化水平，但不影響p38MAPK總蛋白的表達。加入p38MAPK抑制劑SB203580降低細胞中p38MAPK磷酸化水平，同時能夠明顯逆轉(zhuǎn)漢黃芩素誘導(dǎo)的RA-FLS細胞凋亡，這表明漢黃芩素通過激活p38MAPK信號通路誘導(dǎo)RA-FLS細胞的凋亡。另外，加入ROS清除劑NAC能夠抑制p38MAPK的磷酸化，阻斷漢黃芩素誘導(dǎo)的細胞凋亡。因此筆者推斷ROS生成的增加能夠誘導(dǎo)p38MAPK信號通路的激活，介導(dǎo)了漢黃芩素對RA-FLS細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。

綜上所述，漢黃芩素能夠通過誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細胞中ROS的產(chǎn)生，繼而激活p38MAPK信號通路而介導(dǎo)細胞線粒體損傷相關(guān)的凋亡。