王秉義 潘劍

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州 730030

近年來，骨質(zhì)疏松發(fā)病率也呈增加的趨勢，骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為一個世界性的公共衛(wèi)生問題[1]。氧化應(yīng)激作為骨質(zhì)疏松的一個危險因素己受到高度重視，各種類型的骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程中都伴隨氧化應(yīng)激水平的升高和凋亡的發(fā)生[2,3]。因此，具有抗氧化活性的物質(zhì)有可能是防治骨質(zhì)疏松的新靶點(diǎn)[4]。訖今為止，研究最多的天然抗氧化治療骨質(zhì)疏松的藥物是白藜蘆醇[5]。白藜蘆醇能夠清除細(xì)胞內(nèi)的ROS，減緩衰老進(jìn)程并可維持骨密度。丹參中丹參素等水溶性酚酸類成分是天然抗氧化有效成分，結(jié)構(gòu)和白藜蘆醇極其相似，含有多個酚經(jīng)基，可以提供活性氧阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，能提高機(jī)體SOD活性，清除ROS，減少ROS對機(jī)體細(xì)胞造成的損害，改善細(xì)胞缺血缺氧，可預(yù)防心腦血管疾病[6]。本文探究丹參素拮抗氧化應(yīng)激造成成骨細(xì)胞凋亡的作用，為骨質(zhì)疏松的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

4月齡清潔級SD大鼠60只，雌性，體重為(240±10)g，置于安靜、恒溫恒濕、無強(qiáng)光刺激的環(huán)境中飼養(yǎng)。大鼠由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(甘)2013-0006。

1.2 主要試劑與設(shè)備

醋酸撥尼松(批號060328)，廣東華南藥業(yè)；丹參素(純度>85%，批號20140816)，鴻生生物；白藜蘆醇(純度>98%，批號20140908)，鴻生生物；一抗(Bax、AIF、cyto-C、pAkt及β-action)，美國Santa Cruz公司；PI3K抑制劑Ly294002(批號：K1047)，Cayman Chemical公司；胰酶、山羊抗兔IgG-HRP、Western免疫印跡的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，購自美國Sigma公司；α-MEM培養(yǎng)基購自GIBco公司。雙能X線骨密度檢測儀(Lunar美國)，Western blot發(fā)光與凝膠成像系統(tǒng)，美國ALPHA公司；XYJ80-2低速離心機(jī)，江蘇南京金壇恒豐儀器廠；D37520高速離心機(jī)，德國Heraeus公司；電泳儀，美國Biorad公司；電泳槽，美國Biorad公司；SDS_B型倒置生物顯微鏡，中國重慶光電儀器有限公司。

1.3 大鼠分組與給藥

將60只雌性大鼠隨機(jī)分為6組：正常對照組、模型組、丹參素高中低劑量組(30、20、10 mg/kg 體重)和對照藥白藜蘆醇組(5 mg/kg 體重)，每組10只。模型組給大鼠灌胃醋酸潑尼松5mg/kg 體重，給藥體積為10 mL/kg，用0.5%CMC-Na配制0.5mg/mL的濃度。正常對照組大鼠每天灌注同樣體積的0.5%CMC-Na。丹參素組和白藜蘆醇組每日先給予模型組同樣劑量的醋酸潑尼松，之后分別給予丹參素和白藜蘆醇。均按給藥體積為10 mL/kg，用0.5%CMC-Na配制。以上給藥每日次，上午給予醋酸撥尼松，下午給予受試藥物，連續(xù)14w。

1.4 骨密度BMD測定

麻醉處死動物后取右股骨、第四腰椎骨，-4 ℃保存?zhèn)溆?。測定時待骨組織自然恢復(fù)至室溫，采用雙能X線骨密度儀進(jìn)行骨密度測定。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1培養(yǎng)于含10 %的α-MEM培養(yǎng)基當(dāng)中，置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酶常規(guī)傳代。實(shí)驗(yàn)分為4組：A組(正常組)不加任何處理；B組(醋酸潑尼松組)加入終濃度為5 μg/mL 醋酸潑尼松；C組(醋酸潑尼松+丹參素干預(yù)組)加入終濃度為20 μg/mL，D組(醋酸潑尼松+丹參素+Ly294002組)加入終濃度為20 μmol/mL的Ly294002。

1.6 骨組織切片原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)染色

取各組大鼠部分骨組織，進(jìn)行石蠟包埋。在視交叉后1～4 mm處切取10 μm冠狀位骨組織片，每隔4片選取1片，每只大鼠選取5片備用。進(jìn)行常規(guī)脫蠟水合之后加入蛋白酶K(蛋白酶K終濃度為0.8mg/mL)，于37 ℃水浴孵育30 min。每個待檢測樣本中加入50μL TUNEL反應(yīng)混合液(按照TdT：熒光素標(biāo)記dUTP為1：9的比例配制)。每組樣本中加入100 μL DNase I反應(yīng)液，加入含有HRP的熒光素抗體進(jìn)行37 ℃水浴孵育30 min，采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行染色，經(jīng)蘇木素復(fù)染之后，于400倍顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡。如若鏡下出現(xiàn)細(xì)胞核成桔紅色、細(xì)胞質(zhì)不著色、染色質(zhì)呈塊狀凝聚或者裂解為顆粒狀的細(xì)胞，即為陽性染色細(xì)胞。根據(jù)骨組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的計算公式，骨組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100%。

1.7 免疫熒光檢測成骨細(xì)胞MC3T3-E1中pAkt表達(dá)水平

當(dāng)細(xì)胞生長到90%融合時，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，均勻傳代后，以密度為5×104的細(xì)胞密度鋪24空板。第二日早晨分為不同組別進(jìn)行加藥處理。將孔板分為4組，每組6個孔，加藥培養(yǎng)24 h。將長好細(xì)胞的孔板用PBS沖洗3次，每次10 min。再以4%的多聚甲酵固定1 h。固定好的孔板再用PBS沖洗3次，每次10 min。加入0.2%的曲拉通作透化處理，PBS沖洗后以5%BSA溶液在37 ℃水浴中封閉50 min。在吸盡封閉液后加入(1∶200)的p-AKT抗體在4 ℃條件下孵育過夜。用PBS緩沖液沖洗孔板，吸取一抗殘液，避光下加入FITC標(biāo)記的二抗，37 ℃解育1 h后在加入(1∶100)的Hest33342染核處理，經(jīng)過PBS沖洗后在突光顯微鏡下觀察，并拍照。

1.8 Western blot 實(shí)驗(yàn)

從上述各組大鼠骨組織中以及成骨細(xì)胞MC3T3-E1分別提取總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜上，進(jìn)行脫脂奶粉封閉2 h之后用PBS洗膜，分別加入一抗(Bax、AIF、cyto-C和pAkt)(1∶1000稀釋)，4 ℃孵育過夜。進(jìn)行常規(guī)洗膜之后，加入II抗即辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶2000稀釋)并置于室溫中反應(yīng)1 h。經(jīng)洗膜之后采用Image J軟件測定各條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與相應(yīng)的β-actin灰度值的比值作為Bax、AIF、cyto-C和pAkt蛋白的表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨密度BMD測定

與對照組相比，模型組大鼠腰椎、右股骨的BMD值均有降低(P<0.05)，給予低、中、高劑量的丹參素及白藜蘆醇治療后BMD值逐漸升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低、中劑量丹參素與白藜蘆醇差異明顯，高劑量丹參素與白藜蘆醇差異不明顯，見表1。

表1 各組大鼠中骨密度BMD值±s，n=10)Table 1 BMD of rats in each group (±s，n=10)

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，**P<0.05

2.2 各組大鼠骨組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)

從圖1中可以看出，與正常對照組(0.193±0.023%)相比，模型組骨組織中陽性細(xì)胞數(shù)目最多，細(xì)胞核呈桔紅色，細(xì)胞質(zhì)不著色、染色質(zhì)呈塊狀凝聚或者裂解為顆粒狀，細(xì)胞凋亡指數(shù)最大(0.741±0.026%)(P<0.05)；與模型組相比，丹參素各劑量組(從高劑量到低劑量依次為0.385±0.071%、0.296±0.069%、0.193±0.075%)和白藜蘆醇組(0.286±0.053%)骨組織中細(xì)胞凋亡均明顯減少(P<0.05)。

圖1 各組大鼠骨組織中細(xì)胞凋亡檢測Fig.1 The apoptosis in rat bone tissue in each group

2.3 各組大鼠骨組織中Bax、AIF、cyto-C蛋白表達(dá)量

如表2所示，與正常對照組相比，模型組大鼠骨組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、AIF、cyto-C表達(dá)量明顯增加(P<0.05)；與模型組相比，丹參素各劑量組和白藜蘆醇組骨組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、AIF、cyto-C表達(dá)量均明顯減少(P<0.05)，低、中劑量丹參素與白藜蘆醇差異明顯，高劑量丹參素與白藜蘆醇差異不明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 各組大鼠骨組織中Bax、AIF、cyto-C蛋白表達(dá)量±s，n=10)Table 2 The expression of Bax, AIF, and cyto-C protein in rat bone tissue in each group (±s，n=10)

注：與對照組相比,*P<0.05；與模型組相比,**P<0.05

圖2 各組大鼠骨組織中Bax、AIF、cyto-C蛋白表達(dá)Fig.2 The expression of Bax, AIF, and cyto-C protein in rat bone tissue in each group

2.4 免疫熒光檢測各組成骨細(xì)胞MC3T3-E1中pAkt的表達(dá)情況

如圖3所示，從免疫熒光結(jié)果看，A組和B組 pAkt蛋白無明顯區(qū)別，而C組pAkt蛋白表達(dá)明顯比B組增加，D組pAkt蛋白表達(dá)明顯比C組減少。

2.5 成骨細(xì)胞MC3T3-E1中Bax、AIF、cyto-C和pAkt的表達(dá)情況

從Western-blot檢測蛋白表達(dá)結(jié)果看，B, D 2組中Bax、AIF和cyto-C蛋白表達(dá)明顯增高，分別與A組、C組相比差異有顯著性意義(P<0.05)。而C組與B組相比調(diào)亡相關(guān)蛋白Bax、AIF和cyto-C的表達(dá)明顯降低。差異有顯著性意義(P<0.05)。然而，A、B兩組中pAkt表達(dá)量相比并無顯著差異，C組pAkt表達(dá)量明顯高于D組(P<0.05)。

圖3 各組成骨細(xì)胞MC3T3-E1中pAkt免疫熒光表達(dá)Fig.3 The immunofluorescence expression of pAkt in MC3T3-E1 cells in each group

圖4 各組成骨細(xì)胞MC3T3-E1中Bax、AIF、cyto-C和pAkt的表達(dá)Fig.4 The expression of Bax, AIF, cyto-C, and pAkt proteins in MC3T3-E1 cells in each group

組別BaxAIFcyto-CpAktA組0.145±0.0230.136±0.0240.129±0.0220.203±0.019B組0.786±0.021*0.769±0.016*0.698±0.021*0.302±0.015C組0.256±0.014#0.325±0.018#0.295±0.034#0.732±0.013D組0.732±0.021**0.699±0.018**0.678±0.016**0.296±0.024**

注：與A組相比,*P<0.05；與B組相比,#P<0.05；與C組相比,**P<0.05

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種以骨量低下，骨微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病[7,8]。在骨質(zhì)疏松的發(fā)病過程中，氧化應(yīng)激(ROS)甚至凋亡都扮演了重要的角色，各型的骨質(zhì)疏松中都普遍伴有不同程度的成骨細(xì)胞調(diào)亡和氧化應(yīng)激[9,10]。氧化應(yīng)激通過抑制成骨細(xì)胞前體細(xì)胞成熟，使成骨細(xì)胞分化率明顯降低[11]，通過對成骨細(xì)胞的礦化作用的抑制[12]，誘導(dǎo)其凋亡。氧化應(yīng)激也通過對骨髓基質(zhì)細(xì)胞系和成骨細(xì)胞前體細(xì)胞系的分化的抑制發(fā)揮作用[13-15]。眾所周知，長期大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid, GO)能夠誘導(dǎo)繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，即糖皮質(zhì)激素也是誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激并導(dǎo)致生理功能受阻的重要因素[16, 17]。因此拮抗成骨細(xì)胞的凋亡以及氧化應(yīng)激反應(yīng)，可以發(fā)揮減少骨質(zhì)疏松現(xiàn)象的作用[18]。

天然抗氧化劑丹參素是丹參中的一種水溶性多酚酸類成分，具有抗骨質(zhì)疏松的作用[19, 20]。PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路作為細(xì)胞生長，分化，凋亡等細(xì)胞生理代謝的常見通路[21]。為了探究丹參素抗骨質(zhì)疏松的作用是否與拮抗細(xì)胞凋亡以及PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路有關(guān)，在本研究中，我們采用醋酸潑尼松制備大鼠骨質(zhì)疏松模型，探究了丹參素對骨質(zhì)疏松大鼠中骨組織細(xì)胞凋亡指數(shù)以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。白藜蘆醇是目前治療骨質(zhì)疏松常用藥物，因此被研究中采用白藜蘆醇處理組作為陽性對照組。從圖1和圖2可以得知，丹參素能夠抑制醋酸潑尼松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠中骨細(xì)胞的凋亡，明顯降低細(xì)胞凋亡蛋白Bax、AIF、cyto-C的表達(dá)，并且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。與白藜蘆醇組相比，不同濃度丹參素處理組對骨質(zhì)疏松大鼠中骨細(xì)胞凋亡的拮抗能力各不相同，隨著劑量濃度增加而增加。這表明丹參素對骨質(zhì)疏松大鼠具有保護(hù)作用，并且高劑量丹參素處理組對骨質(zhì)疏松大鼠保護(hù)能力高于白藜蘆醇組。對于其機(jī)制研究，我們發(fā)現(xiàn)丹參素能夠上調(diào)成骨細(xì)胞MC3T3-E1中pAkt的表達(dá)，這表明PI3k/Akt通路在丹參素拮抗成骨細(xì)胞MC3T3-E1的凋亡過程中起到關(guān)鍵作用。通過抑制該通路之后，丹參素的抗凋亡作用大大被抑制。因此，我們推斷丹參素拮抗骨質(zhì)疏松中骨細(xì)胞的凋亡是通過PI3k/Akt通路發(fā)揮作用的。但丹參素抗調(diào)亡的作用方式可能不是唯一的。它可能通過其他方式發(fā)揮作用。它或許激活了許多與凋亡相關(guān)的酶類，例如某些鋅指蛋白。也可能通過某些細(xì)胞因子起作用，如胰島素生長因子，轉(zhuǎn)移因子等等。這些還都待進(jìn)一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)的丹參素拮抗氧化應(yīng)激引起的成骨細(xì)胞的凋亡，這可能會是治療骨質(zhì)疏松的新途徑，期待在未來的應(yīng)用中得到檢驗(yàn)。