吳梅 張巍

1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院兒科，北京 100026 2. 航空總醫(yī)院兒科，北京 100012

維生素D的產(chǎn)生與日光中紫外線照射關(guān)系密切，人體對(duì)維生素D需求量的90%以上來自紫外線照射皮膚合成的內(nèi)源性維生素D。雖然日光照射對(duì)人類意義重大，但紫外線過量照射可使皮膚產(chǎn)生紅斑、曬黑、光老化、光敏反應(yīng)、皮膚癌等負(fù)健康效應(yīng)。因此，合理的日光照射顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建不同紫外線暴露條件下的大鼠模型，探討在紫外線總暴露劑量相同情況下，多次小劑量暴露與集中大劑量暴露對(duì)生長(zhǎng)期大鼠血清25-(OH)D濃度的影響，同時(shí)評(píng)價(jià)不同暴露方式對(duì)皮膚產(chǎn)生的副作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

選用21 d齡的雄性Wistar大鼠(由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)90只,體重27.8～55.6 g。大鼠飼以缺乏維生素D飼料，其配方主要成分為：玉米粉76%、麥麩20%、碳酸鈣3%、含碘鹽1%、賴氨酸0.5%以及各種B族維生素，經(jīng)檢測(cè)維生素D含量小于20 IU/kg，可忽略不計(jì)。各組大鼠自由取食，飲用去離子水。

1.2 儀器和試劑

上海希格瑪紫外線光療儀 (UVB)光源，波長(zhǎng)310～313 nm，照射強(qiáng)度為10 mw/cm2。上海寶山顧村電光儀器廠生產(chǎn)ZQJ-254型紫外線強(qiáng)度檢測(cè)儀檢測(cè)不同暴露方式的紫外線照射強(qiáng)度。大鼠血清25-(OH)D 酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒由IDS L td公司提供。

1.3 動(dòng)物飼養(yǎng)

90只大鼠隨機(jī)分為1MED組、1/3MED組、1/5MED組及白熾燈組4組，前3組每組27只，白熾燈組9只。各組均飼以缺乏維生素D飼料，各組大鼠均飼養(yǎng)于不銹鋼籠具，籠高20 cm。動(dòng)物房24 h無日光射入，紫外線強(qiáng)度經(jīng)檢測(cè)為0μW/cm2。實(shí)驗(yàn)期為15 d。

1.4 紫外線照射

照射前用電推子將90只大鼠背部部分皮毛剃去，面積大約為5×3 cm2。除白熾燈組外，其余3組直接置于SigmaSS-01型紫外線光療儀下，用于直接照射的籠具是專門定制的，長(zhǎng)7 cm，寬7 cm，高3 cm，中間有遮擋，可以同時(shí)盛裝2只大鼠，大鼠距紫外線光療儀<1 cm，接受紫外線輻射強(qiáng)度為10 mw/cm2。前期研究表明大鼠的最小紅斑量為5.5 J/cm2。根據(jù)公式：紫外線輻射劑量(J/cm2)=輻射強(qiáng)度(w/cm2)×輻射時(shí)間(s)。1/5MED組大鼠連續(xù)照射15 d，每日照射劑量為1/5MED，照射時(shí)間為1 min 50 s；1/3MED組實(shí)驗(yàn)期內(nèi)間斷照射9 d，每天照射劑量為1/3MED，照射時(shí)間為3 min3 s；1MED組實(shí)驗(yàn)期內(nèi)間斷照射3 d，每天照射量為1MED，照射時(shí)間為9 min10 s；實(shí)驗(yàn)期內(nèi)累計(jì)暴露劑量均為3MED。白熾燈組接受白熾燈照射，經(jīng)檢測(cè)白熾燈下紫外線輻射強(qiáng)度為0 mw/cm2，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)累計(jì)暴露劑量為0 J/cm2。

1.5 血清25-(OH)D檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用5%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉大鼠后，眼球取血1 ml，以3 000 r/min離心10 min后分離血清，儲(chǔ)藏于-20℃至檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)25-(OH)D濃度。

1.6 皮膚損傷的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及方法

參考皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分將刺激反應(yīng)評(píng)分分度[1]。紅斑分度：皮膚未出現(xiàn)紅斑為0分，勉強(qiáng)可見為1分，中度紅斑為2分，嚴(yán)重紅斑為3分，紫紅色紅斑并有焦痂形成為4分。水腫分度：無水腫為0分，勉強(qiáng)可見為1分，皮膚隆起輪廓清楚為2分，水腫隆起約1 mm范圍擴(kuò)大為4分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)大鼠血清25-(OH)D濃度用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行組間比較。皮膚損傷評(píng)分結(jié)果用均數(shù)M(P25，P75)表示，采用完全隨機(jī)化設(shè)計(jì)多組獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清25-(OH)D濃度的比較

4組大鼠血清25-(OH)D濃度差異明顯，F(xiàn)=20.695，P<0.001。1/5MED組(151.97±73.52)nmol/L高于1/3MED組(136.21±71.39)nmol/L，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.966)；1/5MED、1/3MED組均顯著高于1MED組(54.50±20.52)nmol/L和避光組(15.63±0.82)nmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。1MED組高于避光組(P<0.001)。提示日光暴露增加了血清25-(OH)D濃度，多次小劑量暴露在提高血清25-(OH)D濃度方面優(yōu)于集中大劑量暴露。

2.2 各組大鼠照射部位皮膚改變

1/5MED組、1/3MED組、1MED組大鼠在照射劑量達(dá)到1MED后背部皮膚均出現(xiàn)紅斑，而對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)紅斑(圖1)。皮膚損傷的評(píng)分結(jié)果見表1，提示在紫外線暴露所致的紅斑副作用中，多次小劑量暴露產(chǎn)生的副作用小于集中大劑量暴露。

圖1 不同方式紫外線暴露后大鼠皮膚損傷特點(diǎn)。A：1/5MED組，B：1/3MED組，C：1MED組，D：對(duì)照組Fig.1 The skin damage characteristics in rats under different ways of UV exposure. A: The 1/5MED group; B: The 1/3MED group; C: The 1MED group; D: The control MED group

表1 不同紫外線暴露方式對(duì)大鼠皮膚損傷評(píng)分結(jié)果Table 1 The score of skin damage in rats under different ways of UV exposure

注：表格內(nèi)數(shù)據(jù)為M(P25，P75)，4組間比較，P<0.001。

3 討論

3.1 適宜的紫外線暴露頻率與強(qiáng)度有利于獲得較高水平的外源性維生素D

盡管存在廉價(jià)有效的預(yù)防手段，維生素D缺乏仍然是許多國(guó)家的公共健康問題[2]。大量的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，維生素D不足和缺乏普遍存在，其發(fā)生率大約30%～50%[3]。通過日照,太陽的紫外線(波長(zhǎng)290～315 nm)可穿透皮膚，將7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3[4]。而過度日照并不會(huì)造成維生素D中毒，因?yàn)槎嘤嗟木S生素D3可轉(zhuǎn)化為其他數(shù)種光產(chǎn)物而不會(huì)過量[5]。但過量照射可產(chǎn)生紅斑、曬黑、光老化、皮膚癌等負(fù)健康效應(yīng)[6]。因此，合理的日光照射顯得尤為重要。關(guān)于日光照射的研究較多[7]，但多次小劑量暴露和集中大劑量暴露的報(bào)道鮮見。本研究通過建立生長(zhǎng)期大鼠不同方式的紫外線暴露模型，探討相同紫外線總暴露劑量下多次小劑量與集中大劑量暴露對(duì)生長(zhǎng)期大鼠血清25-(OH)D和皮膚的影響，為如何進(jìn)行日光照射提供一定的參考資料。

血清25-(OH)D含量常作為維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況的指標(biāo)[8]。本研究采用的維生素D 缺乏飼料，除維生素D 含量外，其余成分均符合大鼠生長(zhǎng)發(fā)育所需。排除了外源性維生素D的產(chǎn)生途徑，實(shí)驗(yàn)期內(nèi)大鼠體內(nèi)的維生素D全部來自于紫外線照射皮膚所產(chǎn)生，因此血清中25-(OH)D的水平隨著UVB輻射量及暴露方式而改變。本研究顯示1/5MED組血清25-(OH)D濃度最高，其依次為1/3MED組、1MED組和對(duì)照組。1/5MED組和1/3MED組的血清25-(OH)D濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示日光暴露能夠提高血清25-(OH)D的濃度，多次小劑量暴露在提高血清25-(OH)D濃度方面優(yōu)于集中大劑量暴露。

3.2 在獲得外源性維生素D時(shí)要考慮到光毒性帶來的皮膚損害

在特定條件下，人體皮膚接受紫外線照射后出現(xiàn)的肉眼可辨的最弱紅斑需要一定的照射劑量，即皮膚紅斑閾值，通常稱為最小紅斑劑量。紫外線紅斑的形成和皮膚受到的照射劑量有關(guān)。依據(jù)照射劑量的大小，臨床上表現(xiàn)為輕重不等的斑疹，顏色可為淡紅色、鮮紅色或深紅色，可有程度不一的水腫，重者出現(xiàn)水皰。紅斑數(shù)日內(nèi)逐漸消退，可出現(xiàn)脫屑及繼發(fā)性色素沉著。從組織學(xué)的角度來看，紫外線紅斑的本質(zhì)是一種急性光毒性炎癥反應(yīng)[9]，其中真皮內(nèi)血管反應(yīng)是產(chǎn)生紅斑的基礎(chǔ)。本研究顯示1/5MED組在照射5次后背部皮膚開始出現(xiàn)輕度紅斑，輕度無水腫；1/3MED組在照射3次后開始出現(xiàn)中度紅斑，輕度水腫；1MED組大鼠在照射1次后開始出現(xiàn)重度紅斑，中度水腫；而對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)紅斑、水腫。由此可見在紫外線暴露所致的紅斑副作用中，多次小劑量暴露產(chǎn)生的副作用小于集中大劑量暴露。

綜上所述，本研究中1/5MED組和1/3MED組的血清25-(OH)D濃度均有明顯升高的現(xiàn)象，但考慮到1/3MED組的皮膚反應(yīng)較1/5MED組嚴(yán)重，提示為避免皮膚受傷且能獲得足夠的血清25-(OH)D含量，應(yīng)采取多次小劑量暴露。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)正常人在接受紫外線照射的量達(dá)到1MED時(shí)，維生素D停止合成[10]。盡管早期紫外線帶來的傷害是可逆的，在進(jìn)行日光浴時(shí)人們也應(yīng)盡量避免一次達(dá)到1MED。當(dāng)然本研究只選用了大鼠作為研究對(duì)象，未考慮到人類接受陽光照射時(shí)的多重影響因素，如何充分合理獲得陽光照射以提高體內(nèi)維生素D水平，同時(shí)避免過多的日光照射所帶來的皮膚傷害仍有待進(jìn)一步研究[11]。

致謝：感謝馬建榮、武瑋、劉強(qiáng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)的幫助！