馬詩(shī)文，高 云，吳金龍，郝曉亮

(遼寧科技大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 鞍山 114051)

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風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶解大豆分離蛋白制備多肽的研究

馬詩(shī)文，高 云，吳金龍，郝曉亮

(遼寧科技大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 鞍山 114051)

為了改善大豆蛋白的功能性質(zhì)，使其在食品工業(yè)中有更廣泛的應(yīng)用，用酶來(lái)水解大豆蛋白，可以提高大豆多肽的產(chǎn)率。本研究以大豆分離蛋白作為底物，配制不同濃度的大豆分離蛋白溶液，經(jīng)預(yù)處理后，用風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶進(jìn)行酶解，得出兩種酶的酶解最佳條件，即大豆分離蛋白溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶比例為3∶1，pH值為7.5、酶解溫度為45℃、酶解時(shí)間為7 h。在此條件下，溶液的水解度最高，經(jīng)測(cè)定多肽含量為5.162%。

大豆分離蛋白；水解度；酶；多肽

大豆蛋白是國(guó)際上公認(rèn)的較理想的植物蛋白質(zhì)。多肽克服了大豆蛋白在營(yíng)養(yǎng)學(xué)上的弱點(diǎn)，具有比大豆蛋白更豐富的營(yíng)養(yǎng)和功能特性。大豆多肽已經(jīng)成為有效的輔助制劑，在發(fā)酵工業(yè)中，大豆多肽可以作為微生物的營(yíng)養(yǎng)源，促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和代謝；在食品工業(yè)中，大豆多肽可以應(yīng)用于焙烤食品、糖果糕點(diǎn)和冷飲食品中，既降低了成本，也改善了產(chǎn)品的風(fēng)味、口感和組織狀態(tài)等。目前制備大豆多肽的方法主要有微生物發(fā)酵法和酶解法，酶解法有單酶水解法、雙酶水解法以及復(fù)合酶酶解等方法。隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到單酶水解法的不足，多酶復(fù)合水解法漸漸成為了研究的重點(diǎn)，且制得的產(chǎn)品性能普遍高于單酶水解法[1-4]。

本實(shí)驗(yàn)采用大豆分離蛋白為原料，配成大豆分離蛋白溶液，用酶水解生成大豆多肽。風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶均為水解大豆蛋白的常見(jiàn)酶，多數(shù)研究只針對(duì)于兩種酶的單獨(dú)水解，對(duì)于這兩種酶的復(fù)配水解，相關(guān)的報(bào)道并不多。本研究將風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行復(fù)配，同時(shí)通過(guò)兩種酶的復(fù)配來(lái)比較酶的復(fù)配和單一酶對(duì)大豆分離蛋白作用的差異，尋求兩種酶的最佳配比。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，綜合比較選出大豆多肽最佳生產(chǎn)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(哈高科大豆有限責(zé)任公司，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.39%)；風(fēng)味蛋白酶及中性蛋白酶(天津市諾奧科技發(fā)展有限公司，酶活分別為1.839 Ug/ml，2.352 Ug/ml)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DDY-2A凱式定氮儀，JA2003A電子天平，PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，DHZ-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，S212恒速攪拌器，722S可見(jiàn)分光光度計(jì)，HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.3 大豆分離蛋白酶解工藝[5-9]

大豆分離蛋白→85℃保溫15 min→冷卻到酶適宜的溫度→調(diào)節(jié)pH值→放入水浴鍋中，調(diào)節(jié)溫度→加入水解所需的酶→水解適當(dāng)?shù)臅r(shí)間→取出酶解液迅速升溫到90℃并保持20 min滅酶→冷卻→4 000 r/min離心15 min→提取上清液→裝瓶冷藏備用。

1.4 水解度的測(cè)定

采用甲醛滴定法測(cè)定蛋白質(zhì)的水解度[10-11]。取大豆分離蛋白水解液2 ml于錐形瓶中，分別加入20 ml水，加入甲基紅指示劑3滴，用0.05 mol/L NaOH滴至橙黃色，加入40%中性甲醛溶液5 ml，加入酚酞指示劑3滴，再用0.05 mol/L NaOH滴至橙黃色,并記下用量V1。

將大豆分離蛋白用6 mol/L HCl，100℃水解2 h，使蛋白質(zhì)徹底水解。用上述方法測(cè)定，記下用去的0.05 mol/L NaOH的用量V2。

1.5 多肽含量的測(cè)定方法[12]

在酶解液中加入酸，調(diào)至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，經(jīng)離心后，沉淀下來(lái)的是蛋白質(zhì)，而多肽及少量的氨基酸仍留在溶液中，由Folin-酚法測(cè)出上清液中的多肽含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)酶解反應(yīng)的影響

2.1.1 風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的比例對(duì)酶解反應(yīng)的影響

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得知，在風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行復(fù)配時(shí)，風(fēng)味蛋白酶起主要作用，因此，在做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)時(shí)加入了更多的風(fēng)味蛋白酶以提高酶解效果。在前期研究中，筆者重點(diǎn)考察了底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)大豆分離蛋白酶解的影響，最終認(rèn)為4%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)于水解是比較有利的，這與其他文獻(xiàn)報(bào)道的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)是一致的[13-14]。在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、溫度為45℃、時(shí)間為7 h、pH值為7.0時(shí)，取風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶比例為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1來(lái)考查復(fù)合酶配比對(duì)水解度的影響。由表1數(shù)據(jù)可知，當(dāng)風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶的比例選取3∶1時(shí)，能取得較好的酶解效果。

表1 不同復(fù)合酶配比酶解的水解度值

2.1.2 pH值對(duì)酶解反應(yīng)的影響

在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、溫度為45℃、時(shí)間為7 h的條件下，pH值調(diào)節(jié)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的情況下進(jìn)行水解，完成后測(cè)定水解度見(jiàn)表2：

表2 不同pH值酶解的水解度值

由表2數(shù)據(jù)可以看出，水解度的值會(huì)隨著pH值的變化而不同，當(dāng)處于堿性的時(shí)候，水解度會(huì)下降。兩種酶在pH值為7.0的時(shí)候，水解度較高，說(shuō)明水解效果好?？赡苁且?yàn)轱L(fēng)味酶和中性酶等電點(diǎn)均在7.0左右，當(dāng)pH值偏離了其等電點(diǎn)，在堿性條件下，溶液中多余的氫氧根離子可能會(huì)抑制水解反應(yīng)的發(fā)生，影響酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解效果。

2.1.3 溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

用風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行水解，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、時(shí)間為7 h、pH值為7.0的條件下，調(diào)節(jié)酶解溫度為40、45、50、55、60℃，測(cè)定水解度。

由表3可以看出，水解度的值會(huì)隨著溫度的變化有不同，過(guò)低的溫度使酶和蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)沒(méi)有被激活，不利于水解；過(guò)高的溫度會(huì)使酶變性，變性后的酶活性喪失，無(wú)法使蛋白質(zhì)水解。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，兩種酶在溫度為45℃的時(shí)候，水解度相對(duì)較高。

表3 不同溫度酶解的水解度值

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

用風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶兩種酶對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行水解，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、溫度為45℃、pH值為7.0的條件下，水解1、3、5、7、9、11 h，水解完成后測(cè)定水解度。水解度的值會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，但是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)底物逐漸消耗殆盡，酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解停止。如表4所示，當(dāng)時(shí)間為7 h時(shí)，水解已經(jīng)較完全。

表4 不同時(shí)間酶解的水解度值

2.2 雙酶復(fù)合法正交試驗(yàn)

雙酶水解大豆分離蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 雙酶水解大豆分離蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，各個(gè)因素對(duì)酶水解度影響從大到小為:酶解時(shí)間、酶解溫度、復(fù)合酶配比、pH值。雙酶酶解大豆分離蛋白的最佳工藝條件是A3B3C2D2。進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，選取風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶比例為3∶1，pH值為7.5、酶解溫度為45℃、酶解時(shí)間為7 h，得到的水解度為60.42%，高于正交實(shí)驗(yàn)中的各條件下的水解，故此水解條件為最優(yōu)。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)法確定雙酶酶解大豆分離蛋白的最佳工藝條件是底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、風(fēng)味蛋白酶和中性蛋白酶比例為3∶1，pH值為7.5、酶解溫度為45℃、酶解時(shí)間為7 h，此時(shí)得到的溶液水解度最高，經(jīng)測(cè)定多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.162%，酶解后的大豆分離蛋白具有優(yōu)良的特性，可以進(jìn)一步應(yīng)用到食品工業(yè)中。

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(責(zé)任編輯：趙琳琳)

Preparation of polypeptide by cohydrolysis of soybean protein isolated with flavor protease and neutral protease

MA Shi-wen,GAO Yun,WU Jin-long,HAO Xiao-liang

(College of Chemical Engineering, University of Science and Technology LiaoNing, Anshan 114051, China )

In order to improve the functional properties of soybean protein and make it have more extensive application in food industry, the enzyme was used to hydrolyse soybean protein, which could improve the yield of soybean peptides. Using soybean protein isolated as the substrates, different concentrations solutions of soybean protein isolated were prepared, after pretreatment, flavor protease and neutral protease were digested with the solution, the optimum condition were acquired as:the solution concentration of soybean protein isolated was 4%, the ratio of flavor protease and neutral protease was 3∶1, the pH value was 7.5, the enzymolysis temperature was 45℃, the enzymolysis time was 7 h. Under this condition, the degree of hydrolysis of the solution was the highest, the polypeptide content was 5.162% by the experiment.

soybean protein isolated; degree of hydrolysis; enzyme; polypeptide

2017-02-04；

2017-06-23

遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410146000035)；遼寧省普通高等學(xué)校本科教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目(UPRP20140453；2016-145)；遼寧省高等教育研究“十三五”規(guī)劃課題(課題編號(hào)：GHYB160159)；2016年遼寧科技大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(DC2016124)。

馬詩(shī)文(1995-)，女，本科，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

郝曉亮(1980-)，男，講師，博士，研究方向?yàn)樯镏扑幖笆称飞锛夹g(shù)。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.07.011

TS201.2+1;TS 201.2+5

A

1003-6202(2017)07-0043-03