鄭林萍，許光宇,石瑩瑩，宋仕永，張普玉

(1.河南大學 a.藥學院;b.民生學院;c.化學化工學院，河南 開封 475004;2.開封市衛(wèi)生學校，河南 開封 475002)

介孔二氧化硅復合微球的制備及藥物控釋應用

鄭林萍1a，許光宇2,石瑩瑩1b，宋仕永1a，張普玉1c

(1.河南大學 a.藥學院;b.民生學院;c.化學化工學院，河南 開封 475004;2.開封市衛(wèi)生學校，河南 開封 475002)

采用溶膠-凝膠法，以三乙醇胺為堿性沉淀劑，十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為模板劑，正硅酸乙酯(TEOS)為硅源，制備了介孔結構介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)。以硅烷偶聯(lián)劑3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)對介孔二氧化硅進行表面修飾，以甲基丙烯酸(MAA)為原料，采用原位聚合法制備了具有pH響應性的介孔二氧化硅納米粒子@聚甲基丙烯酸(MSNs@PMAA)復合微球。利用小角X射線粉末衍射儀、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡等儀器對其結構和形貌進行了表征。研究結果表明：MSNs@PMAA復合微球平均直徑為167 nm，具有長程有序介孔孔道，MSNs的比表面積、孔容和孔徑分別從1 081 m2/g、1.756 cm3/g 和 3.2 nm 減小至506 m2/g、1.340 cm3/g和1.7 nm。以多柔比星(DOX)為模型藥物，MSNs@PMAA復合微球顯示了較高的載藥率和包封率，在體外有明顯的pH響應性。

介孔二氧化硅納米粒子；溶膠-凝膠法；環(huán)境響應性；藥物控釋

0 引言

介孔二氧化硅納米粒子(mesoporous silica nanoparticles，MSNs)具有規(guī)則的多孔結構，孔道分布均勻且相互獨立，比表面積(>900 m2/g)和孔容(>0.9 cm3/g)高，熱穩(wěn)定性好，孔徑大小可在幾納米到十幾納米內(nèi)進行調(diào)控[1]，因此，其在吸附分離[2-4]、催化反應[5-6]、色譜[7]和生物醫(yī)學[8-12]等領域有廣闊的應用前景。

環(huán)境響應性系統(tǒng)的物理或化學性質會隨著環(huán)境(如溫度、pH值和光等)的改變而發(fā)生相應的變化[13]，所以在藥物輸送中具有很好的應用價值。由于腫瘤細胞組織的pH值比正常細胞略低，呈弱酸性，使得pH響應性復合納米載體廣泛應用于藥物載體研究中[14]。文獻[15]將多柔比星(doxorubicin，DOX)通過腙鍵負載到MSNs表面用于肝癌的治療，腙鍵在酸性的環(huán)境中發(fā)生斷裂，從而使藥物釋放出來。文獻[16]采用ZnO量子點作為介孔二氧化硅孔道的堵封分子，制備了pH響應性的給藥系統(tǒng)，在酸性條件下，ZnO量子點可被降解，從而使藥物從孔道中大量釋放出來。文獻[17]將聚L-谷氨酸(poly-L-glutamic acid,PLGA)修飾到介孔二氧化硅上，制備了pH敏感性的介孔二氧化硅粒子，該產(chǎn)物在水溶液中具有較好的分散性，并且載藥率高，客體分子DOX從MSNs-PLGA中的釋放具有pH響應性，且累積釋放率較高。

DOX是一種臨床常用的蒽環(huán)類抗生素，可抑制癌細胞DNA的合成，然而由于其心臟毒性、骨髓抑制及消化道不良反應等副作用限制了臨床應用[18]。本研究以聚甲基丙烯酸(PMAA)為原料，采用沉淀聚合法制備了具有pH響應性的介孔二氧化硅納米粒子復合微球。并以抗腫瘤藥物DOX為模型藥物，考察該復合微球的負載及體外釋放行為。

1 試驗

1.1 試劑與儀器

正硅酸乙酯(TEOS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)和N，N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)，均購自Aladdin公司；三乙醇胺(TEA)，天津科密歐化學試劑有限公司；過硫酸鉀(KPS)，天津市大茂化學試劑廠；注射用鹽酸多柔比星(DOX·HCl)，深圳萬樂藥業(yè)有限公司。試劑均為分析純。

Bruker D8 Advance型X射線粉末衍射儀(德國Bruker公司)；JOEL 6700E型掃描電鏡(日本JEOL公司)；JEM-2010型透射電鏡(日本JEOL公司)；Nano ZS型激光粒度儀(英國Malvern公司)；AVATAR-360FTIR型光譜儀(美國Nicolet公司)；ASAP 2020M+C型氮氣物理吸附儀(美國Micromeritics公司)；Nano ZS型SDTA851e型熱重分析儀(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 介孔二氧化硅納米粒子@聚甲基丙烯酸(MSNs@PMAA)的制備

稱取模板劑CTAB約0.50 g，加入70 mL去離子水，60 ℃下攪拌溶解，依次加入15 mL乙二醇和 4 mL TEA，混合均勻后緩慢加入TEOS 2.5 mL，溶液由澄清變成乳白色。60 ℃下繼續(xù)反應2 h后，將產(chǎn)物離心，用去離子水和乙醇洗滌至中性，得到正硅酸乙酯-介孔二氧化硅納米粒子(CTAB-MSNs)。

將上述產(chǎn)物轉移到酸性乙醇溶液(9 mL濃鹽酸加入100 mL乙醇)中，80 ℃下加熱回流24 h以去除模板劑，離心純化，用去離子水洗滌至中性，60 ℃真空干燥，即得介孔二氧化硅納米粒子(MSNs)。取0.3 g MSNs分散到20 mL甲苯中，加入200 μL MPS，120 ℃下回流反應6 h，離心分離，并用乙醇洗滌數(shù)次以去除未反應的MPS，60 ℃真空干燥過夜，產(chǎn)物標記為3-(異丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷-介孔二氧化硅納米粒子(MPS-MSNs)。

在帶有冷凝管的三頸燒瓶中，將0.30 g MPS-MSNs溶于60 mL去離子水中，超聲分散。溶解后加入0.70 g 甲基丙烯酸(MAA)。將混合物加熱至70 ℃，氮氣保護下，攪拌1 h后，分別加入0.13 g MBA和 0.06 g KPS，在氮氣保護下繼續(xù)反應6 h。將所制備的產(chǎn)物用乙醇和水反復洗滌以去除未反應的單體和雜質，最后將產(chǎn)物在50 ℃真空中干燥，得介孔二氧化硅納米粒子@聚甲基丙烯酸(MSNs@PMAA)。

1.3 DOX的負載與體外釋放

本試驗采用常用的抗腫瘤藥物DOX作為客體分子，研究復合微球的體外釋放行為。分別稱取10 mg MSNs和10 mg MSNs@PMAA復合微球,分散于質量濃度為1 g/L的DOX水溶液中，室溫下避光搖床振蕩24 h后，取出離心并用去離子水洗滌幾次，合并上清液，用紫外分光光度計在480 nm處測定DOX吸光度。對照標準曲線，計算出其載藥率和包封率。載藥率和包封率計算公式為：

分別稱取10 mg負載DOX的MSNs和10 mg MSNs@PMAA復合微球,溶于5 mL去離子水中，超聲1 min使之在水中分散，然后將其轉移到透析袋中(截留分子量8 000～14 000 )。將其分別放到200 mL(pH值分別為5.5、6.8、7.4)的緩沖溶液中，避光環(huán)境下，37 ℃搖床振蕩，每隔一定時間取出5 mL的溶液測定，并及時補充介質。通過測定DOX的紫外吸光度，計算出不同時間的釋藥率。釋藥率計算公式為：

2 結果與討論

2.1 測試與表征

圖1為MSNs和MSNs@PMAA復合微球的小角X射線粉末衍射圖。從圖1中曲線a 可以看出：在2θ=2.14°處顯示一個很強的衍射峰，相應的衍射晶面指數(shù)為100；另外2個弱的衍射峰分別位于2θ=3.17°和2θ=4.24°，對應的衍射晶面指數(shù)分別為110和200，這屬于典型的有序六方孔道結構[11]。圖1中曲線b在2θ=2.14°處仍有1個衍射峰，但衍射強度有很大程度的降低。這是由于純PMMA是無規(guī)聚合物，沒有衍射峰，MSNs@PMAA在2.14°處仍有峰，說明MSNs孔道負載聚合物后仍然保持二維六方相結構，衍射強度有很大程度的降低，說明MSNs@PMAA復合微球孔道的規(guī)整性有所降低。

圖1 MSNs和MSNs@PMAA復合微球的小角X射線粉末衍射圖

圖2為MSNs和MSNs@PMAA復合微球的掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)圖和透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)圖。從圖2a和2b可以看出：MSNs粒徑分布均勻，粒子呈球形，直徑在 60 nm左右，且孔道排列較為規(guī)整。由圖2c和2d可以看出：MSNs被包覆后直徑比原來稍增大，直徑約為85 nm。

圖3為MSNs和MSNs@PMAA復合微球的的氮氣吸附-脫附曲線和相應的孔徑分布曲線。根據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會(international union of pure and applied chemistry,IUPAC)的分類，樣品的吸附-脫附曲線為典型的IV型等溫曲線，具有HI型滯后環(huán)，表明其具有介孔結構[19]。

圖2 MSNs和MSNs@PMAA復合微球的SEM圖和TEM圖

圖3 MSNs和MSNs@PMAA復合微球的氮氣吸附-脫附等溫線和吸附孔徑分布圖

通過BJH孔徑分布測試計算氮氣吸附-脫附等溫線，可得出：MSNs的比表面積、孔容和孔徑分別為1 081 m2/g、1.756 cm3/g和3.2 nm。在包覆聚合物之后，比表面積、孔容和孔徑分別減小到506 m2/g、1.340 cm3/g和1.7 nm，可為藥物分子提供載入空間。

圖4 CTAB-MSNs、MSNs、MPS-MSNs和MSNs@PMAA復合微球的紅外光譜圖

圖5為MSNs和MSNs@PMAA復合微球的熱失重曲線。MSNs包覆聚合物后，聚合物在加熱到一定溫度時會分解損失質量，而MSNs的質量保持不變。所以通過熱重分析可以計算出聚合物的質量。圖5中顯示MSNs的質量損失率為13.3%，而MSNs@PMAA復合微球的質量損失率為25.4%，這樣，通過計算得到MSNs@PMAA復合微球中聚合物殼層的質量分數(shù)為12.1%，這個結果與TEM觀察到的核殼結構相符合。

圖6為MSNs和MSNs@PMAA復合微球的直徑分布圖，為動態(tài)光散射測量結果。由圖6a可知：MSNs平均直徑為120 nm，多分散指數(shù)PDI=0.22，說明顆粒直徑分布較窄。MSNs@PMAA復合微球的平均直徑為167 nm，PDI=0.21，相比MSNs，其平均流體力學直徑增大了47 nm。通過比較圖6和圖2可發(fā)現(xiàn)：TEM圖顯示的直徑小于動態(tài)光散射測量的結果，這是因為TEM圖是處于高真空干態(tài)下測得的，而動態(tài)光散射測定是在溶液中，其粒子表面存在水化層，故動態(tài)光散射所測的值比TEM偏大。

圖5 MSNs和MSNs@PMAA復合微球的熱失重曲線圖6 MSNs和MSNs@PMAA復合微球的直徑分布圖

2.2 載藥和體外藥物釋放

在pH=8.0時，把DOX載入MSNs@PMAA復合微球里面，根據(jù)DOX紫外吸收標準曲線測得DOX在MSNs@PMAA復合微球中的載藥率為20.5%，包封率為87.4%。作為對比，將DOX負載到MSNs中，得到DOX在MSNs中的載藥率和包封率分別為11.2%和43.8%。試驗結果表明：MSNs在包覆聚合物之后，其載藥率和包封率都有較大提高。

為了研究其釋放性能，分別在pH值為5.5、6.8、7.4條件下，于37 ℃下考察了負載DOX的MSNs@PMAA復合微球對DOX的釋放動力學行為，其累積釋藥曲線如圖7a所示。由圖7a可知：DOX在12 h內(nèi)的累積釋放率相對較快，隨后釋放變慢，并隨pH值的減小，藥物的累積釋放率依次增大。在pH值為7.4時，DOX的累積釋放率很少，只有35.1%的藥物釋放出來；在pH值為6.8時，藥物的累積釋放率有所增加，24 h后為54.6%；當pH值減小至5.5時，藥物的累積釋放率達66.4%。表明MSNs@PMAA復合微球在體外有明顯的pH響應性。作為對比，將DOX負載到純的MSNs中，MSNs的累積釋藥曲線見圖7b。由圖7b可知：不同pH值條件下的藥物釋放率差別很小。24 h內(nèi)，pH值在7.4、6.8、5.5 時，DOX的累積釋放率分別為16%、22%和29%。與MSNs@PMAA復合微球相比，其釋放率明顯減少，所以，MSNs@PMAA復合微球比MSNs在體外具有更好的pH響應性。

圖7 MSNs@PMAA復合微球和MSNs在不同pH值溶液中的累積釋藥曲線

3 結論

本文制備了介孔二氧化硅納米粒子@聚甲基丙烯酸(MSNs@PMAA)復合微球,用DOX作為模型藥物研究了其載藥和體外釋藥行為，其載藥率可達20.5%，包封率為87.4%。在12 h內(nèi)，MSNs@PMAA復合微球中DOX的累積釋放率相對較快，且隨pH值減小而增大，pH 值為7.4、6.8、5.5時，DOX的最大累積釋放率分別為35.1%、54.6%和66.4%。MSN@PMAA復合微球在體外有明顯的pH響應性，有望成為理想的抗腫瘤藥物載體。

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國家自然科學基金項目(51375142)；河南省科技廳科技攻關基金項目(142102210393);河南大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)支持計劃基金項目(MSCXCY2015054)

鄭林萍(1965-),女,河南開封人,教授,碩士,碩士生導師,主要從事藥用高分子材料方面的研究.

2016-07-18

1672-6871(2017)02-0099-06

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.02.019

R944

A