申鈺柯 劉陳業(yè) 周 旦 陳鵬升 陳云霞

DNA條形碼在新型毒品原植物恰特草種屬鑒定中的應(yīng)用研究

申鈺柯 劉陳業(yè) 周 旦 陳鵬升 陳云霞

毒品原植物是指用來提煉、加工成鴉片、海洛因、甲基苯丙胺、嗎啡等麻醉藥物和精神藥物的原植物。其中罌粟、古柯、大麻被稱為世界三大毒品原植物。恰特草作為一種新型毒品原植物近兩年被大量走私入境。

恰特草（Catha edulis），又名：巧茶、也門茶、阿拉伯茶、埃塞俄比亞茶等，屬衛(wèi)矛科（Celastraceae）巧茶屬（Catha）植物，產(chǎn)于東非和阿拉伯半島等地區(qū)。其含興奮化學(xué)物質(zhì)卡西酮，對人體中樞神經(jīng)具有刺激作用，長期嚼食會染癖成癮，又被稱為“東非罌粟”，具有嚴(yán)重的社會危害性。世界衛(wèi)生組織將恰特草歸類為Ⅱ類軟性毒品。很多國家已將其列為興奮劑或受管制藥物，嚴(yán)禁旅客攜帶或郵寄入境。

2014年，恰特草已列入《精神藥品品種目錄（2013版）》，被視為第一類精神藥品，在我國毒品打擊范圍之內(nèi)，凡種植、持有、販賣、走私、服食恰特草均屬違法犯罪行為。

恰特草作為一種新型的毒品原植物，其經(jīng)烘炒后的枝葉，外形酷似茶葉，形態(tài)上具有很高的偽裝性。一些不法分子在高額利潤的驅(qū)使下鋌而走險(xiǎn)進(jìn)行非法走私與貿(mào)易。而目前，恰特草的鑒定依然是依靠傳統(tǒng)的形態(tài)識別，但是對于一些形態(tài)特征被破壞，外觀不完整的檢材并不適用，具有一定的局限性，同時(shí)對案件的辦理也造成了一定阻礙。除此之外，傳統(tǒng)的形態(tài)識別法主要依靠鑒定人的經(jīng)驗(yàn)，對鑒定人的專業(yè)知識要求較高，在無法使用傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒定時(shí)，就需要依靠一些不依賴于形態(tài)特征的新技術(shù)、新方法進(jìn)行識別鑒定。

近年來，DNA分子技術(shù)被廣泛應(yīng)用到植物樣本的檢驗(yàn)，使一些微量植物物證也能進(jìn)行種類鑒定或是個(gè)體識別。并且，多種手段聯(lián)合應(yīng)用于植物物證的檢驗(yàn)將成為一種新的發(fā)展趨勢。國內(nèi)對于毒品原植物的分子鑒定技術(shù)已經(jīng)有一定的研究，但對于新型毒品恰特草的分子鑒定技術(shù)研究還是空白。本研究致力于對恰特草的DNA分子鑒定技術(shù)進(jìn)行探索，以期建立從DNA提取、條形碼片段擴(kuò)增到數(shù)據(jù)分析的恰特草分子鑒定體系，同時(shí)初步建立恰特草的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，實(shí)現(xiàn)恰特草的快速準(zhǔn)確鑒定，為此類毒品案件的打擊提供技術(shù)支持。

一、材料與方法

（一）材料

恰特草新鮮植株由廣州海關(guān)緝私局提供（圖1-A），-20℃保存于國家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心分子實(shí)驗(yàn)室；經(jīng)烘炒處理過的茶葉狀恰特草葉片由南京海關(guān)緝私局提供（圖1-B），常溫保存于國家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心植物實(shí)驗(yàn)室。

圖1 供試材料

（二）方法

1.總DNA的提取

分別取新鮮及烘炒處理的恰特草葉、莖各50mg，液氮速凍，用冷凍研磨儀研磨1min，分別用國產(chǎn)DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）及進(jìn)口的DNeasy Plant Mini Kit植物基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）提取恰特草基因組DNA。DNA的質(zhì)量采用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測。

2.PCR擴(kuò)增及測序

以恰特草DNA為模板，分別用引物rbcL- F（5'- ATGTCACCACAAACAGAAAC-3'）、rbcL-R（5'-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3'），trnL-F-F（5'-TTTGAACTGGTGACACGAG-3'）、trnLF-R（5'-GGTTCAAGTCCCTCTATCCC-3'），擴(kuò)增葉綠體rbcL及trnL-F基因序列。

PCR反應(yīng)在Biometra公司PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為：2.5μL buffer，2μL dNTPs，2μL MgCl2，0.5μL primer-F，0.5 μL primer-R，2 μL DNA，0.2μL Ex-Taq，15.3μL MiliQ H2O。反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫?4℃預(yù)變性5min，然后每個(gè)循環(huán)94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因進(jìn)行測序，測序引物即為擴(kuò)增引物。為保證所測序列的準(zhǔn)確性，對rbcL及trnLF序列進(jìn)行雙向測序。

3.序列分析

對測定的核苷酸序列進(jìn)行序列分析。序列的拼接校準(zhǔn)使用DNASTAR軟件進(jìn)行；序列相似性用NCBI的BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行分析。

二、結(jié)果與分析

（一）提取效果檢測與分析

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，1-3號均在2000bp以上出現(xiàn)完整的條帶（圖2-A），表明在新鮮的恰特草組織中提取到了基因組DNA，但1號與3號樣均有一定的拖帶，說明DNA有一定降解，質(zhì)量不高；2號樣的質(zhì)量相對較好。4號未出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，并未提取到基因組DNA（見圖3），說明經(jīng)烘炒處理過的恰特草葉片中DNA可能已嚴(yán)重降解。通過進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，1-3號DNA都可用來開展下一步實(shí)驗(yàn)（圖2-B）。

（二）rbcL及trnL-F序列片段的獲得及分析

以恰特草基因組DNA為模板，利用rbcL引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中獲得725bp rbcL片段序列（基因登錄號：KX377452）；利用trnL-F引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中獲得453bp trnL-F片段序列（基因登錄號：KX377451）。將其在 NCBI上進(jìn)行BLAST相似性檢索，均與衛(wèi)矛科植物具有一定相似性。但也通過檢索與研究發(fā)現(xiàn)，GenBank中恰特草的DNA條形碼數(shù)據(jù)仍是空白。

三、討論

（一）恰特草DNA提取方法

新鮮的恰特草植株由于其葉和莖的細(xì)胞、形成層細(xì)胞分裂旺盛，代謝過程活躍，物質(zhì)合成迅速，因此新鮮的恰特草植株的細(xì)胞中DNA含量很高，這個(gè)比較有利于DNA的提取。本研究用國產(chǎn)DNA試劑盒（TIANGEN公司）成功地從新鮮的恰特草植株的莖細(xì)胞中抽提出了恰特草DNA。

但目前各地公安機(jī)關(guān)和各海關(guān)部門送檢的恰特草多為經(jīng)處理烘炒過的檢材。經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）無法從處理過的恰特草中提取到可用以進(jìn)一步PCR擴(kuò)增的基因組DNA。主要原因有：①經(jīng)烘炒處理過的恰特草由于受到高溫處理致使DNA發(fā)生降解。②國產(chǎn)DNA試劑盒（TIANGEN公司）提取DNA精度較差，尤其對于一些微量DNA的提取效果不佳。

本研究通過使用進(jìn)口DNeasy Plant Mini Kit植物基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）成功地從經(jīng)烘炒處理過的恰特草樣本的莖中提取出了較高質(zhì)量的DNA。這表明進(jìn)口DNA試劑盒提取DNA精度較高，適用于物證鑒定中提取經(jīng)烘炒處理過的恰特草樣本DNA。

（二）經(jīng)烘炒處理過的恰特草不同部位DNA降解程度不同

通過使用DNeasy Plant Mini Kit植物基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）提取經(jīng)烘炒處理過的恰特草樣本的莖和葉片組織發(fā)現(xiàn)，從莖的組織中能成功提取較高質(zhì)量的基因組DNA，并且能夠用于進(jìn)一步的PCR擴(kuò)增，而葉片組織無法提取到可用于擴(kuò)增的DNA。這說明在經(jīng)烘炒處理過后，恰特草的葉片和莖中的基因組DNA發(fā)生了不同程度的降解[10]，但是莖中的DNA降解程度要明顯低于葉片的降解程度。將此研究結(jié)論應(yīng)用于鑒定過程中，在鑒定經(jīng)烘炒處理過的恰特草檢材時(shí)，應(yīng)盡量選取莖部位的恰特草檢材，由于莖中的DNA降解程度相對葉片較低，這樣更有利于提取恰特草DNA。但由于實(shí)驗(yàn)材料的限制，該實(shí)驗(yàn)僅針對一批烘炒處理的恰特草樣本進(jìn)行了DNA提取實(shí)驗(yàn)，或許不同批次材料處理程度不一樣，其中的DNA降解程度就不同，所以結(jié)論還需進(jìn)一步論證確實(shí)。該部分研究結(jié)論僅供參考。

圖2 DNA檢測

（三）初步建立恰特草DNA條形碼數(shù)據(jù)庫

GenBank是美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫。GenBank也是目前全球公用的最具權(quán)威性、使用最頻繁的DNA序列數(shù)據(jù)庫。將研究獲得的恰特草核苷酸序列在GenBank中進(jìn)行檢索比對，只與衛(wèi)矛科的其他植物具有一定相似性，并未有相似程度高的物種。說明研究獲得的序列無誤，并非其他科屬植物，但也說明一點(diǎn)，目前GenBank中仍缺少恰特草DNA條形碼rbcL與trnL-F序列片段。將獲得的恰特草核苷酸序列上傳到GenBank中，獲取恰特草rbcL的基因登錄號（KX377452）與trnL-F的基因登錄號（KX377451）。

近年來，國家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心也建立了毒品原植物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。通過本研究獲得的恰特草DNA條形碼序列，也豐富與充實(shí)了國家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心毒品原植物的DNA條形碼數(shù)據(jù)庫。對于打擊近年來走私恰特草案件是具有現(xiàn)實(shí)意義，也拓寬了毒品原植物分子鑒定領(lǐng)域的研究。

（四）DNA條形碼鑒定技術(shù)在恰特草實(shí)際鑒定中的應(yīng)用

2016年5月，也門籍犯罪嫌疑人瑪某乘坐某航班，從廣州白云機(jī)場口岸入境。經(jīng)查驗(yàn)，在其行李箱內(nèi)查獲用綠色塑料袋包裹的植物枝葉碎片，凈重78312.4g。廣州海關(guān)緝私局為了查明這起“行李箱藏匿疑似恰特草”案，委托國家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心對涉案的植物進(jìn)行種屬鑒定。但是該涉案植物檢材均為植物枝葉碎片，已無法使用形態(tài)特征進(jìn)行識別鑒定。針對該檢材，使用該論文改良的基因組DNA提取法均成功提取到DNA，并通過與該研究建立的DNA條形碼序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，送檢的3份涉案檢材（圖3）均為恰特草所有，成功進(jìn)行了種屬鑒定。

圖3 廣州海關(guān)緝私局送檢疑似恰特草枝葉碎片

本文系南京森林警察學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（（201612213007）成果

（作者單位 南京森林警察學(xué)院）

（責(zé)任編輯 劉允杰）