郭 音，羅赤苗，陳嘉勤，毛海峰，4，周柏存，鄭 核

GUO Yin1，2，LUO Chi-miao3，CHEN Jia-qin1，MAO Hai-feng1，4，ZHOU Bai-cun1，ZHENG He3

NF-κB信號(hào)通路在小鼠阻塞性黃疸及運(yùn)動(dòng)與黑果枸杞多糖干預(yù)中的差異表達(dá)

郭 音1，2，羅赤苗3，陳嘉勤1，毛海峰1，4，周柏存1，鄭 核3

GUO Yin1，2，LUO Chi-miao3，CHEN Jia-qin1，MAO Hai-feng1，4，ZHOU Bai-cun1，ZHENG He3

目的：探討NF-κB信號(hào)通路在小鼠阻塞性黃疸致肝損傷的機(jī)理及闡述運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黑果枸杞多糖改善肝損傷的效果。方法：KM小鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、枸杞組、運(yùn)動(dòng)組、枸杞+運(yùn)動(dòng)組。應(yīng)用HE染色、免疫組化法、Realtime-PCR技術(shù)對(duì)肝組織進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：1）HE染色顯示，假手術(shù)組肝細(xì)胞索排列整齊；模型組大鼠肝細(xì)胞纖維化，可見片狀肝細(xì)胞變性、壞死，乃至肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂；枸杞組、運(yùn)動(dòng)組可見肝細(xì)胞少量點(diǎn)、片狀壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)改變，肝索排列欠整齊；枸杞+運(yùn)動(dòng)組無明顯組織壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝索排列較整齊。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，枸杞+運(yùn)動(dòng)組小鼠肝組織NF-KB P65、TNF-α陽性表達(dá)均顯著低于模型組。Real-time PCR結(jié)果顯示，與模型組比較，枸杞+運(yùn)動(dòng)組小鼠血清NF-kB、TNF-α、TGF-β、IL-6 mRNA表達(dá)降低。結(jié)論：運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黑果枸杞多糖能改善肝損傷小鼠的免疫功能，對(duì)阻塞性黃疸小鼠的肝細(xì)胞具有修復(fù)作用。

黑果枸杞多糖；有氧運(yùn)動(dòng)；阻塞性黃疸致肝損傷；NF-κB，TNF-α

阻塞性黃疸（obstructive jaundice，OJ）是由各種原因造成肝內(nèi)外膽管阻塞，形成膽汁淤積的一種肝膽系統(tǒng)的疾病，并發(fā)感染率高，死亡率高達(dá)15%～20%［19］。黑果枸杞茄科枸杞屬多年生灌木，是我國(guó)西北地區(qū)特有的一種珍貴野生植物。黑果枸杞多糖是從黑果枸杞中分離提取的糖類復(fù)合物，已有研究表明［1，10，12］，黑果多糖有明顯的肝細(xì)胞保護(hù)活性，且無毒副作用；可滋補(bǔ)肝腎，降低低密度膽固醇，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有抗氧化活性及對(duì)線粒體有保護(hù)作用，同時(shí)具有調(diào)節(jié)血糖和血脂的功能［9，13，14］。中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)［17］對(duì)慢性病有積極的預(yù)防和治療作用，但有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黑果枸杞多糖共同輔助治療阻塞性黃疸，目前國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。

本課題以阻塞性黃疸 KM小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過黑果枸杞多糖及中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)進(jìn)行干預(yù)，觀察肝組織NF-κB、TNF-α、IKK-α、IκB-α mRNA的表達(dá)，試闡述TNF-α介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)因子在不同干預(yù)下表達(dá)差異的可能機(jī)理，并為阻塞性黃疸免疫干預(yù)提供參考方案，為黑果枸杞資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 動(dòng)物模型制作

將50只KM小鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、枸杞組、運(yùn)動(dòng)組、枸杞+運(yùn)動(dòng)組，每組 10 只，均給予基礎(chǔ)飼料和自由飲水。假手術(shù)組小鼠只在腹部剪開一個(gè)長(zhǎng)約1～1.5 cm的切口，縫合作為空白對(duì)照組。

模型組、枸杞組、運(yùn)動(dòng)組、枸杞+運(yùn)動(dòng)組小鼠均構(gòu)建黃疸模型，進(jìn)行參考膽總管扎結(jié)［26］，操作如下：鑷子輕輕夾起備皮皮膚，用小剪刀縱向剪開一個(gè)長(zhǎng)約1～1.5 cm的切口，露出肝臟右葉。距肝門1 cm處分離膽總管，用4-0不可吸收手術(shù)線將膽總管結(jié)扎，避開胰腺組織，再縫合手術(shù)傷口，術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)。

1.2 黑果枸杞多糖的提取與含量測(cè)定

黑果枸杞多糖的提取流程如下：將已清潔的黑果枸杞干果進(jìn)行碾碎，粉末放入8倍體積的80%乙醇溶液中，70 ℃浸泡40 min，濾渣中加入一定量的蒸餾水，水浴1 h，過濾，濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行干燥，剩下的濃縮液用無水乙醇醇沉，去除上清液，將沉淀再進(jìn)行烘干處理后提取出較純的黑果枸杞粗多糖。再利用蒽酮-硫酸法測(cè)定黑果枸杞多糖提取物中多糖的含量。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案

采用中等強(qiáng)度跑臺(tái)訓(xùn)練，坡度為 0%，速度10 m/min，每天固定時(shí)間訓(xùn)練30 min，每周6 d，共6周。正常供水和食物。運(yùn)動(dòng)組、枸杞 + 運(yùn)動(dòng)組于手術(shù)剪斷膽總管固定線7天后再進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練。

1.4 給藥方案

黑果枸杞多糖提取物加入一定比例的蒸餾水，按人與小鼠體表面積折算等效劑量經(jīng)口灌胃。枸杞組和枸杞+運(yùn)動(dòng)組小鼠于手術(shù)后2天剪斷膽總管固定線后固定時(shí)間灌胃黑果枸杞多糖，1次/天，劑量0.3 ml/ 次，共6周。其他組小鼠灌胃等量生理鹽水。

1.5 樣品采集與處理

6周后，取材前5組小鼠禁食，第2天早上用 0.03 ml/g的 10%水合氯醛麻醉處理，用已消毒的鑷子以摘眼球的方法取血至5 ml 抗凝管中，4℃、4 500 rpm 離心 15 min，用移液槍套上TIP頭吸取血清樣品，并做好標(biāo)簽，用小號(hào)離心管分裝并保存于－20℃的冰箱中。用手術(shù)剪剪開腹腔后立即分離出肝臟組織，并進(jìn)行分解。取一定大小的肝組織放入事先準(zhǔn)備好的trizol試劑中，用于肝組織mRNA的提取，部分置于10% 多聚甲醛溶液（0.1M，p H =7.4）固定12 h以上，用于HE染色觀察病理形態(tài)及免疫組化染色分析，剩余的肝組織放入5 ml離心管中，在－70℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 病理學(xué)觀察

HE染色操作步驟：取好肝臟組織，放入裝有10%多聚甲醛的燒杯中固定，利用乙醇由低濃度往高濃度依次進(jìn)行脫水；二甲苯透明使石蠟便能更好地滲入組織，用石蠟進(jìn)行包埋處理，熔點(diǎn)為50～60℃。利用切片機(jī)切成3.0 mm厚的切片，撈片法貼片，HE染色，標(biāo)本過二甲苯至透明后，滴加樹膠進(jìn)行封片，使切片能夠永久保存。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

采用鏈霉親和素生物素復(fù)合物免疫組織化學(xué)染色法（SABC 法） 檢測(cè)肝臟組織NF-kBP65、TNF-α表達(dá)，按照說明書的步驟操作。Olympus（Jarm日本）光學(xué)顯微鏡下（×200）觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)，拍照記錄結(jié)果并保存，PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

采用Simple PCI圖像分析系統(tǒng)（C-imaging公司，美國(guó)）對(duì)免疫組化陽性產(chǎn)物的表達(dá)面積進(jìn)行結(jié)果分析，10×20倍Olympus （Jarm日本）光學(xué)顯微鏡下，觀察NF-kBP65、TNF-α陽性表達(dá)面積，并計(jì)算陽性反應(yīng)面積/測(cè)量面積的數(shù)值，即陽性表達(dá)面積的百分比。

1.8 Real-time PCR程序

儀器：ABI 7900HT，試劑：SYBR? Premix Ex Taq?Ⅱ（Takara）試劑盒，總反應(yīng)體系為25 μl。取1μl cDNA 模板，加入Go Taq@ Green Master Mix，2×12.5 μl、上游引物1μl、下游引物1μl、Naclease-Free water 9.5μl。上述操作均在冰浴上進(jìn)行。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min，94℃ 30 s，引物退火溫度30 s，72℃ 30 min，33個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。

1.9 Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)NF-kB、TNF-α、IKK-α、IκB-α mRNA表達(dá)

總 RNA 提取以及反轉(zhuǎn)錄，mRNA 的逆轉(zhuǎn)錄。PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：將各樣本值代入公式：表達(dá)量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=［目的基因的Ct值（樣本組）-管家基因的Ct值（樣本組）-目的基因的Ct值（校正組）-管家基因的Ct值（校正組）］

1.10 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

利用生物化學(xué)分析法檢測(cè)血清中TBIL、ALT和AST的濃度，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況

在模型構(gòu)建過程中，需要建模的小鼠均未出現(xiàn)手術(shù)或其他原因造成的死亡情況；阻塞性黃疸模型構(gòu)建成功后，小鼠食欲較正常。隨著梗阻時(shí)間的增加，小鼠活躍性減弱、嗜睡。手術(shù) 24 h 后，模型組小鼠尿液顏色變黃，約48 h 后毛發(fā)、皮膚、耳尖開始出現(xiàn)局部發(fā)黃，術(shù)后第2天剖腹檢查時(shí)可見結(jié)扎近端膽總管囊性擴(kuò)張加重，肝臟腫大呈淤膽性改變，血液生化顯示膽紅素水平超標(biāo)，由此現(xiàn)象我們推斷出造模成功，經(jīng)過一段時(shí)間的干預(yù)后，枸杞組、運(yùn)動(dòng)組和枸杞+運(yùn)動(dòng)組小鼠癥狀均輕于模型組。

2.2 肝臟形態(tài)學(xué)觀察

HE 染色結(jié)果（圖1）顯示，假手術(shù)組肝細(xì)胞索呈放射狀排列；模型組小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)纖維化，纖維間隔增寬，排列紊亂，肝索斷裂，核固縮，肝血竇有中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)等；枸杞組、運(yùn)動(dòng)組可見肝小葉結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肝索排列欠整齊，局部可見脂肪變性細(xì)胞，無明顯壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)變化不大，肝纖維化均得到一定的改善，枸杞+運(yùn)動(dòng)組效果最為顯著，肝小葉完整，無變形及壞死現(xiàn)象。

從表1可見，模型組小鼠血清TBIL 、ALT 和AST含量最高，枸杞組血清TBIL、ALT 和AST含量較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。枸杞+運(yùn)動(dòng)組血清TBIL、 ALT和AST含量較枸杞組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。枸杞+運(yùn)動(dòng)組血清TBIL、ALT和AST含量與模型組比較有非常顯著性差異（P＜0.01）。

表1各組血清TBIL、ALT、AST含量的比較（n=10）Table 1 Changes in Serum Levels of TBIL，ALT and AST in Mice （n = 10）.

2.3 各組小鼠肝臟NF-kB P65、TNF-α免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

從圖2可以看出：NF-kB P65、TNF-α表達(dá)多數(shù)在細(xì)胞質(zhì)上，偶見于細(xì)胞核上，NF-kB P65、TNF-α（棕黃色陽性顆粒的散布程度）均依次為模型組、運(yùn)動(dòng)組、枸杞組、枸杞+運(yùn) 動(dòng)組、假手術(shù)組。

圖2 各組小鼠肝組織NF-kB P65、TNF-α免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 （200×）Figure 2. Immunohistochemistry，Paraffin Sections，DAB，200 ×

從表2可知，假手術(shù)組的小鼠中 TNF-α，IKK-α，NF-κB P65 mRNA幾乎都有少量的表達(dá)，小鼠肝組織中NF-kB P65、TNF-α mRNA的含量相對(duì)比，模型組最高，運(yùn)動(dòng)組、枸杞組表達(dá)均水平明顯下調(diào)，低于模型組（P＜0.01）；枸杞+運(yùn)動(dòng)組肝組織中NF-kB P65、TNF-α陽性表達(dá)與模型組對(duì)比有一定比例的下降，兩組間有顯著性差異（P＜0.01）。

2.4 各組小鼠肝臟NF-kB 、TNF-α、IKK-α、IκB-α mRNA檢測(cè)結(jié)果

從表3可見，模型組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α、IKK-α、IκB-α mRNA的CT值最低，假手術(shù)組CT數(shù)值高于枸杞組、運(yùn)動(dòng)組，枸杞+運(yùn)動(dòng)組與模型組相比具有顯著性差異（P＜0.01）；IκB-α 表達(dá)成相反趨勢(shì)，枸杞+運(yùn)動(dòng)組與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組小鼠肝組織NF-kB P65、TNF-α 免疫組織化學(xué)陽性表達(dá)率Table 2 Positive Immunohistochemical Staining （n = 10）.

表3 各組小鼠肝組織NF-kB 、TNF-α、IKK-α、IκB-α mRNA的Ct值Table 3 Mice Liver Tissue NF-kB，TNF-α，IL-6，TGF-β Ct Value

從表4可見，小鼠NF-KB 、TNF-α、IKK-α、IκB-α mRNA的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)與CT值成反比。枸杞組、運(yùn)動(dòng)組、枸杞+ 運(yùn)動(dòng)組與假手術(shù)組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α、IKK-α mRNA表達(dá)倍數(shù)作為對(duì)比，表達(dá)倍數(shù)高低依次為：枸杞+運(yùn)動(dòng)組、枸杞組、運(yùn)動(dòng)組。枸杞+運(yùn)動(dòng)組表達(dá)與假手術(shù)組的表達(dá)最接近，說明其治療效果最好（P＜0.01），；IκB-α 表達(dá)成相反趨勢(shì)，因?yàn)镮κB-α是NF-κB的抑制因子，它下調(diào)了NF-κB、TNF-α、IKK-α mRNA及蛋白的表達(dá)，上調(diào)IκB-α mRNA及蛋白的表達(dá)，可以減弱小鼠的炎癥反應(yīng)，減輕了阻塞性黃疸導(dǎo)致的肝功能損傷。

表4 各組小鼠肝組織NF-κB 、TNF-α、IKK-α、IκB-α與假手術(shù)組的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)Table 4 Relative Expression in Liver Tissue Compared to Control Group

3 討論

阻塞性黃疸主要由于肝外或肝內(nèi)膽管部分性或完全性阻塞所致，皮膚呈暗黃色，血液檢查可見膽紅素濃度顯著升高。因此，降低炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子的釋放，提高機(jī)體免疫功能，抵抗其他并發(fā)癥的發(fā)生，成為治療阻塞性黃疸致肝損傷的關(guān)鍵。而建立合適的動(dòng)物模型非常關(guān)鍵，在以往黃疸造模中，多以大鼠為主［3］。雖然在手術(shù)難度、成活率上，大鼠有一定優(yōu)勢(shì)，但是，大鼠沒有膽囊，生理結(jié)構(gòu)與人類的差異較大，且造模時(shí)間較長(zhǎng)。經(jīng)過文獻(xiàn)查詢，本實(shí)驗(yàn)室使用KM小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象［15］。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們采用結(jié)扎膽總管的方式造模，模擬人類黃疸手術(shù)后的效果。解除膽管懸掛后1周，小鼠手術(shù)后成活率高達(dá)94%，且毛色、尿液等黃疸癥狀明顯；動(dòng)物活動(dòng)性良好，不影響運(yùn)動(dòng)。隨機(jī)抽取7只切開腹腔后發(fā)現(xiàn)膽囊膨脹，肝臟斑點(diǎn)狀發(fā)黃，膽管畸形。所以判斷造模成功，并將此模型用于本實(shí)驗(yàn)。

近年來的細(xì)胞因子與免疫功能關(guān)系的研究甚多。發(fā)生阻黃時(shí)肝臟中的細(xì)胞因子的過量表達(dá)，使炎癥反應(yīng)加深是肝繼發(fā)性損傷的主要原因［20］。人體免疫系統(tǒng)非常復(fù)雜，其功能被各種炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)所調(diào)節(jié)，單一的抑制或促進(jìn)一種炎癥介質(zhì)表達(dá)，對(duì)整個(gè)免疫系統(tǒng)的影響非常渺小。因此，若能在炎癥反應(yīng)調(diào)控的上游尋找相關(guān)的調(diào)控因子，并清楚各種因子之間的相互作用，就能對(duì)認(rèn)識(shí)炎癥機(jī)制有所幫助。

腫瘤壞死因子α（TNF-α）由活化的單核/巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生，能夠與TNF受體結(jié)合［23］，激活TNF受體死亡蛋白（TRADD），后者與TNF受體偶聯(lián)因子2 （TRAF2）結(jié)合，激活NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK）。

NF-κB是一種受調(diào)蛋白水解酶，其信號(hào)通路的組成包括受體和受體近端信號(hào)接頭分子、NF-κB二聚體、NF-κB抑制劑IκB蛋白和IκB激酶（IKK）復(fù)合物［4，16］。 NF-κB的抑制蛋白IκB包括I-κBα、I-κBβ 、I-κBε等亞基，大部分 NF-κB蛋白激活有賴于IκB蛋白泛素化和磷酸化［25，27］。

IKK 復(fù)合體（IκB激酶）是NF-κB信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)物，有3種蛋白組成，即 IKKα、IKKβ、IKKγ。激活NF-κB通路的過程非常復(fù)雜，IKK 復(fù)合體經(jīng)上游激活物與IKKγ相互作用而活化，通過抑制 IKK 激活來阻止IκB磷酸化，從而間接抑制NF-κB的激活。許多通路及細(xì)胞因子可導(dǎo)致NF-κB的激活［7，22］，這些通路的進(jìn)行幾乎全部包括IKK的激活、IκB的降解以及NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)。TNF-α就是一種NF-κB的刺激模式。

本實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動(dòng)組、枸杞組及枸杞+運(yùn)動(dòng)組NF-kB P65、TNF-α表達(dá)比模型組明顯減弱，提示，6周有氧運(yùn)動(dòng)、黑果枸杞多糖灌胃、運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黑果枸杞多糖灌胃，下調(diào)了NF-κB、TNF-α、IKK-α mRNA及蛋白的表達(dá)，上調(diào)IκB-α mRNA及蛋白的表達(dá)，減少與其下游的信號(hào)分子結(jié)合，從而減弱了小鼠的炎癥反應(yīng)，減輕了其肝功能的損傷。與運(yùn)動(dòng)組和黑果枸杞組的結(jié)果相比，運(yùn)動(dòng)聯(lián)合黑果枸杞多糖組治療阻塞性黃疸的效果最佳，表明兩者具有協(xié)調(diào)作用。研究表明，TNF-α介導(dǎo)的NF-kB 信號(hào)通路在肝損傷中起到關(guān)鍵性作用。

阻塞性黃疸患者容易發(fā)生各種并發(fā)癥，如感染、肝腎功能衰竭、內(nèi)毒素血癥等，直接影響病人的治愈。近年來研究表明，阻塞性黃疸患者機(jī)體免疫功能受到抑制，導(dǎo)致病人手術(shù)期并發(fā)癥和死亡率居高不下。

蔡文麗［2］研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期進(jìn)行中低強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)可增強(qiáng)小鼠的免疫能力，減輕肝細(xì)胞微損傷，促進(jìn)肝功能的恢復(fù)。Rough-neen［24］取結(jié)扎膽總管大鼠的脾淋巴細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，大鼠的T淋巴細(xì)胞功能受到抑制。CD 4/CD 8的比值是目前最有說服力的免疫力指征［8］。適當(dāng)運(yùn)動(dòng)引起機(jī)體CD 4/CD 8比值上升，血清 Ig G、Ig A 和 Ig M 水平提高，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫力［18］。運(yùn)動(dòng)的效果與運(yùn)動(dòng)的形式、強(qiáng)度大小、時(shí)間長(zhǎng)短有著密切的聯(lián)系，機(jī)體免疫機(jī)能會(huì)隨著運(yùn)動(dòng)持續(xù)的時(shí)間發(fā)生適應(yīng)性改善。

隨著現(xiàn)代天然藥物和醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，人們關(guān)注到免疫系統(tǒng)與生物體衰老、癌變、炎癥以及自由基代謝失衡有著直接關(guān)聯(lián)，會(huì)導(dǎo)致各種慢性疾病的發(fā)生。天然生物多糖是非細(xì)胞毒物質(zhì)，廣泛參與細(xì)胞的生命活動(dòng)，產(chǎn)生多種生物學(xué)功能，是理想的免疫增強(qiáng)劑［5］，越來越受到研究人員的重視?，F(xiàn)已進(jìn)入臨床研究的有香菇多糖、人參多糖等。

黑果枸杞多糖［21］是從含多種營(yíng)養(yǎng)成分的黑果枸杞中分離提取的多糖復(fù)合物，有明顯的肝細(xì)胞保護(hù)活性，可滋補(bǔ)肝腎，增強(qiáng)免疫功能。李進(jìn)［11］等對(duì)小鼠進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，黑果枸杞是無毒物質(zhì)，最大耐受劑量及3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果皆為陰性，未表現(xiàn)出致突變性，對(duì)受試動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、肝腎等功能均無損害作用。這表明，黑果枸杞有較好的食用安全性，可藥、食兩用，有很好的開發(fā)利用前景。已有研究證實(shí)：黑果枸杞多糖具有抗疲勞作用［6］，能促進(jìn)糖尿病小鼠的血糖轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃?，?duì)糖尿病也有防治作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,枸杞組、枸杞+運(yùn)動(dòng)組血TBIL、ALT和AST均低于模型組，提示，黑果枸杞多糖用于阻塞性黃疸致肝損傷小鼠的輔助治療方面作用明顯。

4 展望

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，黑果枸杞多糖和中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)用，對(duì)小鼠阻塞性黃疸致重癥肝損傷有保護(hù)作用。作用機(jī)制可能與TNF-α介導(dǎo)的 NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，小鼠的免疫能力和抗炎能力得以提高，阻塞性黃疸性肝損傷得以緩解。

［1］ 陳?？蚜杩?，曹君邁，等.黑果枸杞的研究現(xiàn)狀及其開發(fā)利用［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（5）：155-157.

［2］ 蔡文麗.有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)酒精性脂肪肝損傷小鼠ALT，AST，IL-6，IL-10等的影響［J］.沈陽體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，32（3）：89-92.

［3］ 陳曉琴.黑果枸杞果實(shí)多糖的制備與抗疲勞、降血糖生物功效的研究［D］.烏魯木齊：新疆師范大學(xué)，2007.

［4］ 鄧韻婷，熊興東，孫雪榮，等.NF-κB 信號(hào)通路與細(xì)胞衰老［J］.生命的化學(xué)，2013，33（4）：401-406.

［5］ 馮薇，何恩鵬，陳曉琴，等.黑果枸杞果實(shí)多糖對(duì)小白鼠運(yùn)動(dòng)能力影響及量效研究［J］.干旱區(qū)研究.2009，4（26）：586-590.

［6］ 李爾春，丁紅軍，金曉輝，等.天然植物多糖的結(jié)構(gòu)及活性研究進(jìn)展［J］.食品與藥品，2007，9（4）：51-54.

［7］ 劉杰，闞丹.IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路阻斷及臨床應(yīng)用［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（23）：4147-4149.

［8］ 劉莉，林建椂，成偉棟，等.T淋巴細(xì)胞及其亞群與運(yùn)動(dòng)免疫［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2003，7（18）：26-34.

［9］ 李淑珍，李進(jìn).黑果枸杞總黃酮降血脂作用［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（5）：1072-1074.

［10］ 李林，王茂材，羅赤苗，等.大柴胡湯聯(lián)合運(yùn)動(dòng)對(duì)阻塞性黃疸大鼠肝臟炎癥細(xì)胞因子的影響［J］.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2011，30（9）：836-844.

［11］ 李進(jìn)，原惠，曾獻(xiàn)春，等.黑果枸杞色素的毒理學(xué)研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（7）：470-475.

［12］ 王超，蔣寶平，龍軍，等.黑果枸杞對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)及其抗氧化作用的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2015，26（2）：192-195.

［13］ 汪建紅，陳曉琴，張蔚佼，等.黑果枸杞果實(shí)多糖降血糖生物功效及其機(jī)制研究［J］.食品科學(xué)，2014，35（22）：162-166.

［14］ 夏娜，趙麗鳳.黑果枸杞功能性成分抗氧化活性及對(duì)線粒體的保護(hù)作用研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，30（5）：162-166.

［15］ 余水平，李堅(jiān)，侯冰宗，等.急慢性大鼠梗阻性黃疸模型的建立［J］.世界華人消化雜志，2011，19（12）：1285-1289.

［16］ 嚴(yán)明，陳萬濤.NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.北京口腔醫(yī)學(xué)，2007，15（1）：53-55.

［17］ 周愛國(guó).紅景天對(duì)肝纖維化大鼠 TNF-α介導(dǎo)的 NF-κB 通路［D］.西寧：青海大學(xué)，2011.

［18］ 趙福臨，劉奇才.有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)人體細(xì)胞免疫功能影響的實(shí)驗(yàn)分析［J］.閩江學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，28（5）：116-118.

［19］ 趙艷平.阻塞性黃疸機(jī)體免疫功能的研究進(jìn)展［J］.江西醫(yī)藥，2009，44（11）：147-149.

［20］ BENJAMIN L.Toxicology and applied，Pharmacol［J］.2015，283（3）：168–177.

［21］ CUI D，ZHONG S，M A J，et al.Short interfering RNA targetting NF-kappa B induces apoptosis of hepatic stellate cells and attenuates extracellular matrix production［J］. Dig Liver Dis，2010，42（11）：813-817.

［22］ HAYDEN M S，GHOSH S.Signaling to NF-kappaB.Genes Dev， 2004，18（7）：2195-2224.

［23］ LASZLO N，ROLAND A.Compromis of immune function in obsrtuctivejaundice［J］.Eur J Surg，2002，168（6）：315-328.

［24］ ROUGHNEEN T P，KIDLARKE R，KUMART S C，et al.Impaired specific cell mediated immunity in experimental biliary obstruction［J］.J Surg Res，1986，41（2）：113-116.

［25］ TRIPATHI P，AGGARWAL A.NF-k B transcription factor：a key player in the generation of immune response［J］.Current Sci，2006，90（4）：519-531.

［26］ WARRDLE E N，WRIGHT N A. Edontoxin and acute renal failure associated with obstructive jaundice［J］.BMJ，1970，4（2），472-477.

［27］ VALLABHAPURAPU S，KARIN M.Regulation and its regulation and function of NF-kappaB transcription factors in the immune system［J］.Ann Rev Immunol，2009，27（6）：693-733.

The Differential Expression of NF-κB Signaling Pathways in Obstructive Jaundice-induced Liver Injury in Mice with Aerobic Exercise and Black Fruit Wolfberry Polysaccharide

Objective：To explore the mechanism of NF-κB signaling pathways in liver injury induced by obstructive jaundice in mice，and to discuss the effect of exercise combined with black fruit wolfberry polysaccharides on liver injury. Methods：KM mice were randomly divided into five groups：sham surgery group，model group，medlar group，aerobic exercise group，wolfberry-exercise group. The liver tissue was detected by HE staining，immunohistochemistry and Realtime-PCR. Results：HE staining：sham group hepatic cord neatly arranged cells；cells of rat liver fibrosis model group，visible patches of liver cell degeneration，necrosis，hepatic cord structure and even cell disorder；wolfberry group，aerobic exercise group showed hepatocytes a small amount of points，necrosis，lobular structural changes，hepatic cord neatly arranged owe；wolfberry + exercise group had no significant tissue necrosis，lobular structure normal hepatic cord arranged in neat. Immunohistochemical staining showed：Wolfberry + exercise group liver tissue NF-kB P65，expression of TNF-awere significantly lower than the model group. Real-time PCR results showed that：compared with the model group，Chinese wolfberry + exercise group serum NF-kB，TNF-a，TGF-b，IL-6 mRNA was decreased.Conclusion：Combined exercise with Lyciumbarbarum polysaccharide can improve the immune function of mice with liver injury，and repair the hepatocytes of obstructive jaundice mice.

black fruit wolfberry polysaccharide；aerobic exercise；obstructive jaundice induced liver injury；NF-κB；TNF-α

1002-9826（2017）04-0119-06

10. 16470/j. csst. 201704017

G804.5

A

2016-04-20；

2017-05-21

郭音，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹卮蠹膊〉男滤幣c運(yùn)動(dòng)干預(yù)。

陳嘉勤，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)，生物化學(xué)。

1.湖南師范大學(xué) 體育學(xué)院， 湖南 長(zhǎng)沙，410012；2.湖南

中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校， 湖南 株洲，412012；3.邵陽市中心醫(yī)院， 湖南 邵陽，420000；4.宜春學(xué)院， 江西 宜春，336000

1.Hunan Normal University，Changsha，410012 China；2.Hunan Traditional Chinese Medical College，Zhuzhou，412012，China；3. Shaoyang Central Hospital，Shaoyang 420000，China；4.Yichun University，Yichun336000，China.