戴培慧 馬瑞蓮 高佳麗 劉天龍

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部，呼和浩特，010050)

基于HPLC分析柴胡黃芩配伍的主要化學(xué)成分研究

戴培慧 馬瑞蓮 高佳麗 劉天龍

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部，呼和浩特，010050)

目的：基于高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)分析柴胡黃芩配伍的主要化學(xué)成分，闡釋中藥合理配伍的科學(xué)內(nèi)涵。方法：采用HPLC指紋圖譜分析進(jìn)行精密度試驗(yàn)測試HPLC儀器的精密度；重復(fù)性試驗(yàn)測試HPLC指紋圖譜方法的重復(fù)性；穩(wěn)定性試驗(yàn)測試樣品的穩(wěn)定性。HPLC指紋圖譜：取10批柴胡黃芩，精密吸取5 μL按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，根據(jù)色譜條件依次測定并記錄10批柴胡黃芩配伍的色譜圖。結(jié)果：1)柴胡黃芩精密度試驗(yàn)中峰面積大于總峰面積5%的峰有22、30、36和47號峰。2)重復(fù)試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)中各主要色峰的相似度均大于0.99，顯示良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。3)10批柴胡黃芩HPLC指紋圖譜中大于總峰面積5%的共有峰面積為22、30、36、47號色譜峰，且10批柴胡黃芩配伍的藥液相似度均>0.99，顯示相似度良好。4)柴胡黃芩配伍的水煎液中，大多數(shù)物質(zhì)歸屬柴胡，45 min以后的色譜峰是柴胡的特征峰，而15～45 min多集中了黃芩的特征峰；主要化學(xué)成分為柴胡皂苷a和黃芩苷。結(jié)論：柴胡黃芩配伍的水煎液中主要化學(xué)成分為柴胡皂苷a和黃芩苷。

HPLC;柴胡;黃芩;配伍;化學(xué)成分

化學(xué)研究藥物的成分及藥代動力學(xué)是藥物配伍(包括藥對)在不同層面及角度的的研究手段，是研究方劑的突破口[1-4]。藥對是人類反復(fù)臨床實(shí)踐的結(jié)晶，是病患相應(yīng)癥候的真實(shí)反映，亦是中藥復(fù)方的關(guān)鍵之所在，因此對藥對的探索是研究中藥復(fù)方的基礎(chǔ)，利用現(xiàn)代技術(shù)手段研究藥對配伍及其化學(xué)成分的變化規(guī)律是繼“拆解古方”及“組合新方”后又一研究中藥復(fù)方的新重點(diǎn)[5-8]。

柴胡-黃芩藥對首載于醫(yī)圣張仲景名著《傷寒論》中小柴胡湯方中，是和解少陽的經(jīng)典名方，目前仍被廣泛運(yùn)用。張仲景認(rèn)為柴胡-黃芩是和解少陽的基本結(jié)構(gòu)，二藥合用可“透泄半表之邪、清散半里之熱”，后世醫(yī)家更是在此配伍特點(diǎn)的啟發(fā)下開發(fā)大量相關(guān)中成藥，并通過臨床或者動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)柴胡、黃芩藥對的療效[9-13]。今我們化學(xué)研究手段對柴胡-黃芩進(jìn)行化學(xué)成分變化規(guī)律進(jìn)行分析，以期進(jìn)一步探討改藥對藥效作用的最佳配伍關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相(HPLC)(Agilent 1100型高效液相色譜儀)。

1.2 試劑 乙腈，0.1%磷酸。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 精密量取20 μL的樣品進(jìn)樣量或?qū)φ掌啡芤?，采?50 mm×4.6 mm，4 μm的色譜柱(Synergi Hydro-RP C18柱)，在乙腈和0.1%磷酸的流動相中，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，根據(jù)高效液相色譜儀指紋圖譜的梯度洗脫程序進(jìn)行試驗(yàn)。見表1。

表1 HPLC指紋圖譜梯度洗脫程序(檢測波長未315 nm)

2.2 供試品溶液制備 柴胡藥用部位為傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根，黃芩藥用部分為唇形科黃芩屬多年生草本植物的干燥根，柴胡黃芩采用1∶1配伍，采用回流法煎煮，于敞口藥盆中稱取20 g柴胡加200 mL水，浸泡30 min，煮沸后文火45 min再加入等量黃芩，煮沸后文火15 min，取100 mL藥液，在60 ℃下減壓濃縮，定容至50 mL，折合柴胡黃芩藥物水煎液濃度未0.2 g/mL。取5 mL柴胡黃芩濃縮液用100%甲醇定容10 mL，混合均勻，取2 mL離心取上清液在0.45 μm超微膜濾過即可。見圖1。

圖1 柴胡黃芩配伍水煎液HPLC圖譜主要色譜峰

2.3 內(nèi)參峰S峰的選擇 目前供柴胡和黃芩HPLC測定用的對照品有柴胡皂苷a和黃芩苷，但由于柴胡皂苷a和黃芩苷在水煎液中的含量較低，故不宜做本研究的內(nèi)參峰S，因此根據(jù)圖1中吸收峰面積最大，保留時(shí)間最長的43 min左右的5號峰作為本研究的內(nèi)參峰S。

2.4 高效液相(HPLC)指紋圖譜分析

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液根據(jù)2.2制備的供試品溶液，依照2.1的色譜條件，連續(xù)5次進(jìn)樣，測試HPLC儀器的精密度。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品溶液根據(jù)2.2制備的供試品溶液，依照2.1的色譜條件，連續(xù)5次進(jìn)樣，測試HPLC指紋圖譜方法的重復(fù)性。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液根據(jù)2.2制備的供試品溶液，依照2.1的色譜條件，連續(xù)5次進(jìn)樣，測試樣品的穩(wěn)定性。

2.4.4 指紋圖譜 取10批柴胡黃芩，精密吸取5 μL按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，根據(jù)色譜條件依次測定并記錄10批柴胡黃芩配伍的色譜圖。為了分析柴胡黃芩配伍的主要化學(xué)成分，根據(jù)2.2供試品溶液制備方法，分別單獨(dú)制區(qū)遠(yuǎn)志水煎液(0.2 g/mL)和厚樸水煎液(0.2 g/mL)。

2.5 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)國家藥典委員會提出的中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A進(jìn)行相似度分析，采用MATLAB軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)。

2.6 樣品測定結(jié)果

2.6.1 精密度考察結(jié)果 柴胡黃芩精密度試驗(yàn)中各色譜峰相對保留時(shí)間和峰面積見圖2，其中峰面積大于總峰面積5%的峰有22、30、36和47號峰。見表2。

圖2 精密度試驗(yàn)各色譜圖

峰號第1次第2次第3次第4次第5次平均RSD(%)18(S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0000220.3660.3700.3680.3850.3710.3722.021300.4540.4410.4500.4240.4340.4412.750360.5010.5010.5030.4920.5140.5021.564470.4010.3860.3790.4060.4270.4004.684

2.6.2 重復(fù)試驗(yàn)考察結(jié)果 由圖3和表3可知，重復(fù)試驗(yàn)中各主要色峰的相似度均大于0.99，顯示良好的重復(fù)性。

2.6.3 穩(wěn)定性考察結(jié)果 由圖3和表3可知，穩(wěn)定性試驗(yàn)中各主要色峰的相似度均大于0.99，顯示良好的穩(wěn)定性。

圖3 重復(fù)試驗(yàn)考察結(jié)果

重復(fù)度1重復(fù)度2重復(fù)度3重復(fù)度4重復(fù)度5對照指紋圖譜重復(fù)度11.0000.9940.9920.9950.9900.997重復(fù)度20.9941.0000.9961.0000.9920.997重復(fù)度30.9920.9961.0000.9920.9970.996重復(fù)度40.9950.9960.9921.0000.9920.997重復(fù)度50.9900.9970.9970.9921.0000.998

圖4 穩(wěn)定性考察結(jié)果

穩(wěn)定性1穩(wěn)定性2穩(wěn)定性3穩(wěn)定性4穩(wěn)定性5對照指紋圖譜穩(wěn)定性11.0000.9970.9970.9970.9970.998穩(wěn)定性20.9971.0000.9990.9990.9990.999穩(wěn)定性30.9970.9991.0001.0000.9991.000穩(wěn)定性40.9970.9990.9990.9991.0000.999穩(wěn)定性50.9980.9991.0001.0000.9991.000

圖5 10批柴胡黃芩HPLC指紋圖譜

2.6.4 10批柴胡黃芩水煎液的指紋圖譜 10批柴胡黃芩水煎液HPLC指紋圖譜詳見圖5、表5、表6，10批柴胡黃芩HPLC指紋圖譜中大于總峰面積5%的共有峰面積為22、30、36、47號色譜峰，且10批柴胡黃芩配伍的藥液相似度均>0.99，顯示相似度良好。

表5 10批柴胡黃芩HPLC指紋圖譜中大于 總峰面積5%的共有峰面積

表6 10批柴胡黃芩藥液相似度結(jié)果

2.6.5 柴胡黃芩配伍HPLC指紋圖譜各主要化學(xué)成分分析 由圖6、7可得，柴胡黃芩配伍的水煎液中，大多數(shù)物質(zhì)歸屬柴胡，45 min以后的色譜峰是柴胡的特征峰，而15～45 min多集中了黃芩的特征峰，主要化學(xué)成分為柴胡皂苷a和黃芩苷。

圖6 柴胡黃芩配伍中歸屬于柴胡所含化學(xué)成分的指紋圖譜

3 討論

藥對配伍是復(fù)方發(fā)揮臨床療效的核心，大量臨床文獻(xiàn)已證實(shí)柴胡、黃芩藥對配伍有協(xié)同增強(qiáng)療效的作用[14-15]，本研究對該藥對的化學(xué)成分物質(zhì)變化情況進(jìn)行探析?；贖PLC技術(shù)測定柴胡、黃芩配伍前后柴胡的主要有效成分柴胡皂苷a和黃芩主要有效物質(zhì)是黃芩苷的含量。本研究利用乙腈和0.1%磷酸進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果顯示分離效果理想，保留時(shí)間適中。在所選擇的色譜柱條件下我們發(fā)現(xiàn)柴胡及黃芩各成分分離度高，色譜峰尖銳，分離時(shí)間亦理想，實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分可靠。該研究采用各地的10批柴胡及黃芩進(jìn)行指紋圖譜檢查分析，結(jié)果顯示不同批次的圖譜結(jié)果基本一致，在相似度檢測中各批藥材的相似度尚可，這說明經(jīng)過國家藥物質(zhì)量監(jiān)督部分的努力，現(xiàn)中藥藥材市場上的柴胡及黃芩質(zhì)量較前明顯改善。

圖7 柴胡黃芩配伍中歸屬于黃芩所含化學(xué)

序號RT(min)成分歸屬成分來源1516.35±0.024黃芩苷黃芩2225.76±0.026黃芩苷黃芩1843.08±0.014柴胡皂苷a柴胡3051.12±0.23柴胡皂苷a柴胡3660.23±0.27柴胡皂苷a柴胡4768.37±0.22柴胡皂苷a柴胡

本研究在獲取的色譜的條件下快速、準(zhǔn)確的分析柴胡、黃芩及其同煎液的化學(xué)成分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果體現(xiàn)了該方法具有理想的精密度、可重復(fù)性及穩(wěn)定性，在藥液煎煮過程中并無產(chǎn)生新的化學(xué)成分，10批柴胡的主要成分均是柴胡皂苷a，而黃芩的主要成分也只是黃芩苷，這說明此次研究的柴胡及黃芩藥材穩(wěn)定均一，在有效化學(xué)成分分析中我們發(fā)現(xiàn)柴胡黃芩配伍的水煎液中，大多數(shù)物質(zhì)歸屬柴胡，45 min以后的色譜峰是柴胡的特征峰，而15～45 min多集中了黃芩的特征峰，因此我們認(rèn)為該要對的理想煎煮時(shí)間應(yīng)集中于15～45 min，才可充分體現(xiàn)柴胡、黃芩的最大藥效。

HPLC完整體現(xiàn)了柴胡、黃芩的組成特征，同時(shí)驗(yàn)證了該藥對產(chǎn)生最大藥物效價(jià)的時(shí)間，以期指導(dǎo)臨床運(yùn)用。

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(2017-03-31收稿 責(zé)任編輯：張文婷)

Study on Main Chemical Components from Compatibility of Chaihu and Huangqin by HPLC

Dai Peihui, Ma Ruilian, Gao Jiali, Liu Tianlong

(Pharmacydepartment,AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohehot010050,China)

Objective:To analyze the main chemical components from compatibility of Chaihu and Huangqin by HPLC and to explain the scientific connotation of rational compatibility. Methods:High performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint was used for test precision of HPLC instrument. Repeatability of HPLC fingerprint method was test and sample stability was also tested. HPLC fingerprint:Ten batches of Chaihu and Huangqin were taken and 5 μL solution was prepared according to the conditions of chromatography and the chromatogram. Fingerprint of compatibility of Chaihu and Huangqin was determined and recorded. Results:1) The peak areas in the precision test over 5% of the total peak area were No. 22, 30, 36 and 47. 2) The similarity of the main color peaks in the repeatability test and the stability test was greater than 0.99, which showed good repeatability and stability. 3) The total peak areas of the HPLC fingerprint of the ten batches of Chaihu and Huangqin greater than the total peak area were No. 22, 30, 36, and 47 and the similarity of the chemical compatibility of the ten batches of Chaihu and Huangqin was above 0.99, showing a good similarity. 4) Most substances in the decoction of Chaihu with Huangqin came from Chaihu and chromatographic peak after 45 min was the characteristic peak of Chaihu, while characteristic peak of Huangqin mainly appeared during 15～45 min. The main chemical components were saikosaponin a and baicalin. Conclusion:The main components in decoction of Chaihu and Huangqin were saikosaponin a and baicalin.

HPLC; Chaihu; Huangqin; Compatibility; Chemical composition

內(nèi)蒙古教育廳課題(NJZY4157)

戴培慧(1971.06—)，女，大學(xué)本科，研究方向：中西醫(yī)藥學(xué)，E-mail：925873412@qq.com

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.07.046