孫位軍++++++汪福強++++++徐文龍++++++王張++++++宋文杰++++++王杰++++++劉光麗++++++劉勁松++++++陳一龍

[摘要] 目的 研究醫(yī)用膠原蛋白調(diào)節(jié)TNF-α治療變應(yīng)性接觸性皮炎的作用及機制。方法 制造二硝基氟苯致小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎模型，醫(yī)用膠原蛋白連續(xù)14 d涂抹動物皮膚，對耳部組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，應(yīng)用ELISA方法測試TNF-α、IL-2等炎癥介質(zhì)。 結(jié)果 與攻擊前比較，各組小鼠在攻擊后12、24 h均出現(xiàn)十分明顯的耳變態(tài)反應(yīng)（P < 0.01）；與空白對照組比較，醫(yī)用膠原蛋白低劑量組小鼠在攻擊后12 h時耳變態(tài)反應(yīng)評分升高（P < 0.05），在攻擊后24 h時模型對照組耳變態(tài)反應(yīng)評分明顯升高（P < 0.05）；與模型對照組比較，在攻擊后24 h時醫(yī)用膠原蛋白低、中和高劑量組小鼠的耳變態(tài)反應(yīng)評分均降低（P < 0.05）。與空白對照組比較，模型對照組、地塞米松對照組和醫(yī)用膠原蛋白低、中、高劑量組小鼠右耳片的炎癥細(xì)胞數(shù)明顯地增加（P < 0.01）；與模型對照組比較，地塞米松對照組和醫(yī)用膠原蛋白低、高劑量組小鼠右耳片的炎癥細(xì)胞數(shù)減少（P < 0.05或P < 0.01）。與空白對照組比較，模型對照組、地塞米松對照組和醫(yī)用膠原蛋白中、高劑量組小鼠左右耳片厚度差明顯地變大（P < 0.01）。與模型對照組比較，醫(yī)用膠原蛋白低劑量組小鼠左右耳片厚度差變小（P < 0.05）；與空白對照組比較，模型對照組和醫(yī)用膠原蛋白低劑量組小鼠血清中炎癥因子TNF-α含量明顯地升高（P < 0.01）；與模型對照組比較，地塞米松對照組小鼠血清中炎癥因子TNF-α含量明顯地降低（P < 0.01），醫(yī)用膠原蛋白高劑量組小鼠血清中炎癥因子TNF-α含量明顯降低（P < 0.05）；對動物體重沒有明顯影響。 結(jié)論 醫(yī)用膠原蛋白對變應(yīng)性接觸性皮炎有明顯的治療作用，可能通過調(diào)節(jié)血清中TNF-α進(jìn)而減輕耳部炎性反應(yīng)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 醫(yī)用膠原蛋白；變應(yīng)性接觸性皮炎；炎性反應(yīng)；TNF-α

[中圖分類號] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（c）-0188-05

[Abstract] Objective To study the adjust TNF-α of medical collagen treats ACD and mechanism. Methods Duplication ACD models were made， the mouse skin was smeared with this medical collagen for about 14 days as a therapy， ear tissue were given histopathological examination， ELISA was used to test the levels of TNF-α，IL-2 inflammatory mediators. Results Compared with pre attack， ear allergy were very obvious in all group after attack 12， 24 h （P < 0.01）. Compared with blank control group， the ear allergy increased in medical collagen low does group after attack 12 h （P < 0.05）， the ear allergy increased in model control group after attack 24 h （P < 0.05）. Compared with model control group， the ear allergy reduced in medical collagen low， middle， high does group after attack 24h （P < 0.05）. Compared with blank control group， inflammatory cells of the right ear increased in all group mouse （P < 0.05）. Compared with model control group， inflammatory cells of the right ear reduced in dexamethasone control group， medical collagen low， high does group （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with blank control group， the left and right ear piece thickness difference enlarged obviously in model control group， dexamethasone control group， medical collagen middle and high does group （P < 0.01）. Compared with model control group， the left and right ear piece thickness difference decreased in medical collagen low does group mouse （P < 0.05）. Compared with blank control group， TNF-α level increased obviously in model control group and medical collagen low does group mouse （P < 0.05）. Compared with model control group， TNF-α's level reduced in dexamethasone control group and medical collagen high does group mouse （P < 0.01 or P < 0.05）. Meanwhile， this therapy did not influenced the animals' weight. Conclusion Medical collagen can be a certain medical treatment for ACD， but it may connect with the adjust of the level of TNF-α and then decrease of the ear inflammation.

[Key words] Medical collagen； ACD； Inflammatory reaction； TNF-α

膠原蛋白是人體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)，是組織的基本成分之一，約占人體蛋白質(zhì)總量的1/3，分布于身體的各個器官之中。因其具有多種性質(zhì)，可在細(xì)胞（尤其是成纖維細(xì)胞）表面黏附、趨化、生長、分化及介導(dǎo)免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物材料和臨床治療。醫(yī)用膠原蛋白敷貼由Ⅰ型膠原蛋白原液和無紡布組成，用于輕中度痤瘡引起的皮膚炎癥的治療，可抑制和緩解面部激光、光子治療術(shù)后會出現(xiàn)的疼痛、紅斑等炎性反應(yīng)，還可減輕創(chuàng)面愈合期色素沉著，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

炎性反應(yīng)是痤瘡發(fā)生的重要病理過程，是導(dǎo)致局部毛囊組織破壞而出現(xiàn)膿皰、結(jié)節(jié)及疤痕等的主要原因。在痤瘡發(fā)生的炎性反應(yīng)早期，促炎因子在炎性反應(yīng)部位產(chǎn)生，從而促進(jìn)了炎癥細(xì)胞聚集繼而引發(fā)一系列的炎性反應(yīng)[1]。醫(yī)用膠原蛋白對皮膚炎癥具有明顯治療作用，但對治療變應(yīng)性接觸性皮炎（ACD）及其作用機制尚未研究，研究[2-3]發(fā)現(xiàn)TNF-α在二硝基氟苯致ACD過程中發(fā)揮重要作用，故本研究采用二硝基氟苯致小鼠ACD，初步探討醫(yī)用膠原蛋白調(diào)節(jié)TNF-α對ACD的治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

醫(yī)用膠原蛋白，臨床使用的濃度為2 mg/mL，成人日用劑量為0.1523 mg/（cm2·d）[4]，由成都維德醫(yī)療器械有限責(zé)任公司提供，批號：20140301。醋酸地塞米松乳膏，由國藥集團三益藥業(yè)（蕪湖）有限公司生產(chǎn)，批號：130507。

1.2 實驗動物

ICR種小鼠，SPF級，64只，雌雄各半，體重18～22 g，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-24，實驗動物合格證號：0018614。

1.3 實驗試劑

2，4-二硝基氟苯[西亞試劑（山東分公司），分析純]，橄欖油（成都市科龍化工試劑廠，分析純），丙酮（成都市科龍化工試劑廠，分析純）；以4∶1的丙酮：橄欖油配成 1%的二硝基氟苯溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；TNF-α、IL-2（北京永輝生物科技有限公司進(jìn)口分裝）；4%多聚甲醛固定液、脫水試劑、透明試劑、蘇木素染液、伊紅染液、鹽酸-乙醇分化液、封片試劑和蓋玻片清洗液等。

1.4 實驗儀器

酶標(biāo)儀（賽默飛世爾儀器有限公司生產(chǎn)）；2015型轉(zhuǎn)輪式切片機（德國徠卡Leica儀器有限公司）；BMJ-Ⅲ型包埋機（常州郊區(qū)中威電子儀器廠）；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）；數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；電子天平（賽多利斯儀器有限公司，量程：200 g，精確度為1 mg）。

1.5 方法

1.5.1 給藥 將ICR種小鼠隨機分為空白對照組、模型對照組[5-6]、地塞米松對照組、醫(yī)用膠原蛋白低、中、高劑量組。于小鼠右耳廓內(nèi)、外兩面以微量移液槍移取液體或棉簽?zāi)景舳翁羧∪楦嗑鶆蛲磕ㄔ谄つw表面（1 cm2）給藥，連續(xù)14 d。

1.5.2 造模 在給予藥物第10天后2 h進(jìn)行第1次致敏，即空白對照組于腹部去毛區(qū)域涂抹50 μL的丙酮橄欖油混合液（4∶1），另外5組涂抹50 μL的1%二硝基氟苯[7-9]；在給予藥物第11天后2 h同樣方法進(jìn)行第二次致敏。在給予藥物第14天后2 h，用100 μL的生理鹽水溶液洗掉小鼠右耳廓內(nèi)外兩側(cè)的藥物，再以10 μL的1%二硝基氟苯進(jìn)行攻擊。

1.5.3 測試指標(biāo) 于攻擊前和攻擊后12、24 h分別對其雙耳變態(tài)反應(yīng)評分詳見表1；攻擊24 h后麻醉小鼠，眼球取血，分離血清，應(yīng)用ELISA法測定炎癥因子TNF-α和IL-2；組織病理學(xué)方法測定右耳片的炎癥細(xì)胞數(shù)和左右耳片厚度差。

沿耳廓基線剪下兩耳，制成HE染色切片，按參考文獻(xiàn)[10]方法，在光學(xué)顯微鏡400倍鏡下，取右耳片5個不重疊視野，計數(shù)炎癥細(xì)胞數(shù)量（個），取平均值；在光學(xué)顯微鏡100倍鏡下，選擇左右耳組織切片中部，距耳緣端4 mm處的耳雙面距離，垂直于軟骨進(jìn)行耳厚度測量，每只耳測量5次，取平均值；計算攻擊后小鼠左、右耳厚度差（mm）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，符合正態(tài)分布時采用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），其中方差齊則采用 LSD -t檢驗，方差不齊則采用Tamhane's T2檢驗，不符合正態(tài)分布時采用非參數(shù)檢驗（Nonparametric Tests）。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重

與模型對照組比較，其它各組小鼠體重，在給予第1、8、15天時，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。空白對照組小鼠體重，在第8天時較第1天時明顯增長（P < 0.01），且第15天時較第8天時增長（P < 0.01）。地塞米松對照組小鼠體重，在給予第8、15天時較第1天時均沒有明顯增長（P > 0.05）。模型對照組和醫(yī)用膠原蛋白低、中、高劑量組小鼠體重，在給予第8天時較第1天時明顯增長（P < 0.01），但給予第15天時較第8天時沒有明顯增長（P > 0.05），維持在第8天的水平。見表2。

2.2 小鼠耳變態(tài)反應(yīng)

攻擊前，各組小鼠均未出現(xiàn)耳變態(tài)反應(yīng)。與攻擊前比較，各組小鼠在攻擊后12、24 h時均出現(xiàn)明顯耳變態(tài)反應(yīng)（P < 0.01）。與空白對照組比較，醫(yī)用膠原蛋白低劑量組小鼠在攻擊后12 h時耳變態(tài)反應(yīng)評分升高（P < 0.01），模型對照組、地塞米松對照組和醫(yī)用膠原蛋白中劑量組小鼠在攻擊后12 h時耳變態(tài)反應(yīng)評分升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），其醫(yī)用膠原蛋白高劑量組無明顯差異；在攻擊后24 h時模型對照組耳變態(tài)反應(yīng)評分升高（P < 0.05），其它組無明顯差異。與模型對照組比較，地塞米松對照組、醫(yī)用膠原蛋白中、高劑量組小鼠在攻擊后12 h時的耳變態(tài)反應(yīng)評分有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），在攻擊后24 h時醫(yī)用膠原蛋白低、中和高劑量組小鼠的耳變態(tài)反應(yīng)評分均降低（P < 0.05）。見表3。

2.3 小鼠血清中炎癥因子

與空白對照組比較，模型對照組和醫(yī)用膠原蛋白低劑量組小鼠血清中炎癥因子TNF-α含量明顯升高（P < 0.01），地塞米松對照組、醫(yī)用膠原蛋白中、高劑量組TNF-α含量均升高但無統(tǒng)計學(xué)差異（P > 0.05）。與模型對照組比較，地塞米松對照組小鼠血清中炎癥因子TNF-α含量明顯降低（P < 0.01）以及醫(yī)用膠原蛋白高劑量組小鼠血清中炎癥因子TNF-α含量降低（P < 0.05）。見表4。

2.4 小鼠右耳片炎癥細(xì)胞數(shù)和左右耳片厚度差

與空白對照組比較，模型對照組、地塞米松對照組和醫(yī)用膠原蛋白低、中、高劑量組小鼠右耳片炎癥細(xì)胞數(shù)明顯增加（P < 0.01）；與模型對照組比較，地塞米松對照組和醫(yī)用膠原蛋白低、高劑量組小鼠右耳片的炎癥細(xì)胞數(shù)減少（P < 0.05或P < 0.01）。與空白對照組比較，模型對照組、地塞米松對照組和醫(yī)用膠原蛋白中、高劑量組小鼠左右耳片厚度差明顯地變大（P < 0.01），表明涂抹二硝基氟苯再次攻擊可導(dǎo)致小鼠右耳廓明顯腫脹，而醫(yī)用膠原蛋白低劑量組左右耳片厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；與模型對照組比較，醫(yī)用膠原蛋白低劑量組小鼠左右耳片厚度差變?。≒ < 0.05）。見表5、圖1～2。

3 討論

ACD是以炎癥細(xì)胞浸潤及組織變性壞死為主要病理特征的炎性反應(yīng)[11]，由T細(xì)胞介導(dǎo)的針對皮膚接觸致敏原的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（Ⅳ型）。Th細(xì)胞是根據(jù)功能分類的T細(xì)胞亞群，其中Th1細(xì)胞因子主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)；Th2細(xì)胞因子主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，在正常情況下Th1和Th2處于動態(tài)平衡，兩種細(xì)胞通過分泌不同的細(xì)胞因子彼此相互調(diào)節(jié)，維持機體的正常免疫功能[12-13]。在ACD 效應(yīng)階段，當(dāng)再次接觸相同致敏原時，Th1/Th2 的這種動態(tài)平衡發(fā)生失衡，以TH1細(xì)胞起主導(dǎo)作用，其分泌的主要炎癥因子有IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-17等細(xì)胞因子[14]，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子[15]。IFN-γ是ACD效應(yīng)階段極為重要的炎癥因子，可調(diào)節(jié)抗原的呈遞和淋巴細(xì)胞的的增殖與分化，是最有效的巨噬細(xì)胞激活因子，同時還能活化多種細(xì)胞，調(diào)節(jié)多種免疫活性介質(zhì)的合成和分泌，加重炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ通過刺激和調(diào)節(jié)ROS的活性而影響ACD反應(yīng)。在ACD誘導(dǎo)致敏期，T細(xì)胞在接觸抗原位點后，釋放的TNF-α起著重要的作用。在抗原刺激后各種表皮細(xì)胞分泌的 TNF-α迅速增加，導(dǎo)致了朗格漢斯細(xì)胞從表皮遷移到了局部的淋巴結(jié)，并可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，上調(diào)黏附分子和協(xié)同共刺激分子的表達(dá)[16-17]。IL-2主要是Thl 細(xì)胞在抗原或絲裂原刺激下分泌的一種糖蛋白，是 Thl 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子之一，它在輔助性T細(xì)胞生長、增殖和分化的各個階段都發(fā)揮重要作用[18]。IL-17在ACD效應(yīng)期能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性因子，調(diào)節(jié)趨化因子CXCL1及黏附分子ICAM-1表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化和向炎癥部位募集，加重局部炎性反應(yīng)。

在評估一些藥物治療ACD的療效時，通常使用的是接觸性變態(tài)反應(yīng)的動物模型，能簡單快速地反映ACD的臨床病理過程、篩選有效的治療藥物，其中DNFB建立小鼠耳廓 ACD 模型是目前學(xué)界最常用的動物模型之一[19]。DNFB是一種半抗原，將其稀釋液涂抹腹壁皮膚后，與皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，由此刺激T淋巴細(xì)胞增殖成致敏淋巴細(xì)胞。4～7 d后再將其涂抹于耳部或足爪皮膚，使局部產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)或稱變應(yīng)性接觸性皮炎。

醫(yī)用膠原蛋白在治療ACD過程中可能抑制TH1細(xì)胞分泌IFN-γ而減少炎癥細(xì)胞數(shù)量，其中以醫(yī)用膠原蛋白低劑量和高劑量作用最強，而醫(yī)用膠原蛋白中劑量與陽性對照藥（地塞米松）較接近，3個劑量組均能減少炎癥細(xì)胞數(shù)量，其中醫(yī)用膠原蛋白中劑量可能存在延遲效應(yīng)。醫(yī)用膠原蛋白對血清中炎癥因子IL-2的作用在本實驗中表現(xiàn)不顯著，但對血清中炎癥因子TNF-α有抑制作用，而TNF-α主要由Th1細(xì)胞分泌，它在ACD的發(fā)病過程中發(fā)揮著促進(jìn)炎性反應(yīng)、改變血管內(nèi)皮通透性、增加滲出等作用[20]。因此醫(yī)用膠原蛋白對變應(yīng)性接觸性皮炎的治療作用，可能與調(diào)節(jié)血清中TNF-α有關(guān)。

本研究組還發(fā)現(xiàn)，醫(yī)用膠原蛋白對二甲苯致小鼠耳廓腫脹和雞蛋清致大鼠足腫脹均有抑制作用，對熱板致小鼠足部疼痛有止痛作用，支撐了醫(yī)用膠原蛋白可抑制和緩解紅腫熱痛的臨床應(yīng)用，此研究內(nèi)容尚未發(fā)表。

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