劉志文+劉波+吳琪+陳銀芳+徐彭+謝慧慧+王瑩+楊碩

[摘要] 該實(shí)驗(yàn)為探究二仙湯防治骨質(zhì)疏松的作用及對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨蛋白質(zhì)組的影響。將雌性SD大鼠按體重隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、模型組、阿侖膦酸鈉組（阿侖膦酸鈉，1 mg·kg^-1）、二仙湯組（生藥量8 g·kg^-1），其中假手術(shù)組和模型組灌服生理鹽水，阿侖膦酸鈉組按1 mg·kg^-1劑量灌服阿侖膦酸鈉，二仙湯組按生藥量8 g·kg^-1灌服二仙湯，每日1次，連續(xù)給藥90 d后檢測(cè)股骨骨密度，同時(shí)應(yīng)用Nano-LC-LTQ-Orbitrap系統(tǒng)檢測(cè)股骨骨蛋白，Protein Discovery軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，SIEVE軟件對(duì)蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二仙湯能顯著提高去卵巢大鼠股骨骨密度。二仙湯組與模型組相比較共發(fā)現(xiàn)41個(gè)與假手術(shù)組趨勢(shì)一致的差異蛋白，主要包括生物氧化相關(guān)蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白、脂肪酸代謝相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、糖代謝相關(guān)蛋白等。二仙湯能防治骨質(zhì)疏松癥，碳酸酐酶2、整合素β1等相關(guān)差異蛋白質(zhì)可能是其作用靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 二仙湯；去卵巢骨質(zhì)疏松；骨密度；蛋白質(zhì)組學(xué)

[Abstract] This experiment was mainly aimed to investigate the effect of Er-xian decoction on osteoporosis and the femur proteomics in ovariectomized rats with osteoporosis. The female SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， Alendronate group （1 mg·kg^-1）， Er-xian decoction group （in dose of 8 g·kg^-1） according to their weight. The rats in sham operation group and model group were gavaged with normal saline；the rats in Alendronate group were gavaged with the Alendronate at the dose of 1 mg·kg^-1 and the rats in Er-xian decoction group were gavaged with Er-xian decoction at the dose of 8 g·kg^-1 ， once a day for continuous 90 days. Then the femoral bone mineral density （BMD） was detected. The femoral bone proteins were detected by NanoLC-LTQ-Orbitrap system， identified by Protein Discovery software， and the intensity of differentially expressed proteins were quantitated by SIEVE software. The results showed that Er-xian decoction could significantly improve femoral BMD in ovariectomized rats. As compared with model group， 41 differentially expressed proteins whose variation trend was consistent with the sham operation group， were found in Er-xian decoction group， mainly including biological oxidation related protein， signal transduction pathway related protein， proteins involved in aliphatic acid metabolism， cytoskeleton related protein， proteins involved in energy metabolism， and proteins involved in glucose metabolism etc. The osteoporosis could be prevented and cured by Er-xian decoction. The differentially expressed proteins such as carbonic anhydrase 2 and integrin β1 may be the action targets for Er-xian decoction.

[Key words] Er-xian decoction；ovariectomized osteoporosis；bone mineral density；proteomics

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是絕經(jīng)后婦女的一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，臨床主要是以骨量減少、骨的微結(jié)構(gòu)破壞為特征，骨骼脆性增加，易發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病[1]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在骨質(zhì)疏松治療中發(fā)揮重要作用。二仙湯是上海中醫(yī)藥大學(xué)已故名醫(yī)張伯訥教授針對(duì)圍絕經(jīng)期綜合征研制的名方，由淫羊藿、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、知母、黃柏6味中藥組成[2-3]。作者前期研究已發(fā)現(xiàn)二仙湯能顯著提高去卵巢大鼠骨密度，有效防治骨質(zhì)疏松[4]，但分子作用機(jī)制并不清楚。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)能針對(duì)靶組織分析蛋白質(zhì)的變化，是尋找人類(lèi)疾病的新生物標(biāo)志物和發(fā)現(xiàn)藥物治療新靶點(diǎn)的一種工具[5]。骨組織是骨質(zhì)疏松癥、骨腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的主要發(fā)病部位，疾病發(fā)生往往伴隨蛋白質(zhì)的變化。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在骨組織中尋找二仙湯干預(yù)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的差異蛋白，挖掘二仙湯防治骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)8月齡雌性SD大鼠，24只，體重300～400 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2013-0004。

1.2 藥物

二仙湯方中含有仙茅、淫羊藿、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏、知母6味藥，均購(gòu)自江西樟樹(shù)天齊堂中藥飲片有限公司，由本院中藥資源組付小梅副教授鑒定為朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai.，仙茅Curculigo orchioides Gaertn.，巴戟天Morinda officinalis HOW，當(dāng)歸Angelica sinensis （Oliv.） Diels，知母Anemarrhena asphodeloides Bge.，黃柏Phellodendron chinensis Schneid.。阿侖膦酸鈉（批號(hào)E1217060）購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司。

1.3 試劑

RIPA高效裂解液（批號(hào)RA223336A），苯甲基磺酰氟（PMSF）（批號(hào)RE2173411），BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)RD231234），二硫蘇糖醇（批號(hào)RD232079），碘代乙酰胺（批號(hào)SLBP7486V）等均購(gòu)自Thermo scientific公司；測(cè)序級(jí)胰酶（批號(hào)0000117588）購(gòu)自Promega公司；乙酸（批號(hào)SHBG4397V），丙酮（批號(hào)SHBF3379V），碳酸氫銨粉末（批號(hào)BCBN6056V）等均購(gòu)自Sigma-aldrich公司。

1.4 儀器

雙能X線吸收骨密度儀（DXA，Lunar公司，美國(guó)）；ORBITRAP ELITE質(zhì)譜儀（Thermo公司，美國(guó)）：EASY-nLC 1000 液相儀（Thermo公司，美國(guó)）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司，德國(guó)）；ELX800吸收光酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek儀器有限公司）；分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；C₁₈旋轉(zhuǎn)柱（Thermo Pierce公司，美國(guó)）；離心濃縮儀（LABCONCO公司，美國(guó)）；EASY-Spray Column（Thermo公司，美國(guó)）；Acclaim PepMap100（Thermo公司，美國(guó)）。

1.5 二仙湯的制備

計(jì)算給藥量之后按照2∶2∶2∶2∶1∶1的比例分別取仙茅、淫羊藿、當(dāng)歸、巴戟天、黃柏、知母，加入雙蒸水至液面高出藥材表面2 cm，先浸泡30 min，武火煎煮40 min，后文火煎煮30 min，反復(fù)煎煮2次，最后將2次藥液合并，將提取液濃縮至生藥質(zhì)量濃度0.8 g·mL^-1。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模、分組及給藥

將動(dòng)物隨機(jī)分為4組，其中18只去卵巢[6]的雌性大鼠隨機(jī)分為3組：模型組、阿侖膦酸鈉組、二仙湯組，每組6只，以?xún)H作手術(shù)切開(kāi)而未作卵巢切除的6只雌性大鼠為假手術(shù)組，假手術(shù)組與模型組均灌服生理鹽水，阿侖膦酸鈉組按1 mg·kg^-1劑量灌服陽(yáng)性對(duì)照藥物阿侖膦酸鈉，二仙湯組按生藥量8 g·kg^-1灌服二仙湯，給藥容積均為0.01 mL·g^-1，所有動(dòng)物連續(xù)給藥90 d。

2.2 骨密度檢測(cè)

采用雙能X線吸收骨密度儀對(duì)大鼠左股骨骨密度檢測(cè)。

2.3 蛋白組學(xué)

2.3.1 蛋白樣品前處理 骨組織全蛋白提?。弘S機(jī)挑選每組各3只大鼠右側(cè)股骨樣本，剪下骨骺端用錫箔紙包裹后搗碎，精密稱(chēng)取0.15 g，置于預(yù)先冷凍干燥的潔凈研缽中，將組織粗略研磨后快速加入液氮研磨組織成粉末狀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，加入1 mL配置好的裂解液（RIPA裂解液-PMSF100∶1），置于搖床上4 ℃搖40 min，將其4 ℃，14 000×g離心40 min，棄去細(xì)胞沉淀上清液即為骨組織蛋白，以BCA試劑盒測(cè)定各樣品蛋白濃度，放-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白質(zhì)的酶解：將蛋白樣品在4 ℃融化，取20 μL樣品，加入適量DTT溶液，37 ℃水浴60 min，加入適量IAA溶液，避光反應(yīng)45 min，加入5倍量-20 ℃預(yù)冷的冰丙酮，-20 ℃沉淀過(guò)夜。樣品4 ℃，14 000×g離心5 min，棄去上清液，并加入丙酮1.0 mL，渦旋混勻后，4 ℃，14 000×g離心5 min，棄去上清液，重復(fù)3次，以清洗蛋白。將蛋白重懸于100 mmol·L^-1碳酸氫銨溶液600 μL中，按照酶-蛋白1∶50加入測(cè)序胰酶，37 ℃恒溫水浴酶解過(guò)夜。加入適量8%乙酸，使pH小于6以終止酶解反應(yīng)。

多肽的除鹽及凍干：將酶解完的樣品按照Pierce C₁₈Spin Columns說(shuō)明書(shū)中的步驟進(jìn)行脫鹽處理，最后將多肽洗脫液用離心濃縮儀進(jìn)行冷凍干燥，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 樣品檢測(cè) 用0.1%甲酸溶液80 μL溶解樣品，Nano-LC-LTQ-Orbirap聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè)。

色譜條件：分析柱為EASY-Spray C₁₈色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm），預(yù)柱為Acclaim PepMap100（C₁₈，75 μm×2 cm，3 μm）。流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B為0.1%甲酸乙腈。進(jìn)樣量4 μL，流速250 nL·min^-1，柱溫30 ℃。蛋白樣品流動(dòng)相濃度梯度見(jiàn)表1。

LTQ Orbitrap Elite質(zhì)譜條件：正離子模式，噴霧電壓1.7 kV，毛細(xì)管溫度250 ℃。一級(jí)圖譜開(kāi)啟FTMS掃描模式，二級(jí)圖譜35%的碰撞能量，采用Ion trap掃描模式，掃描范圍300～1 800。

2.4 數(shù)據(jù)分析

骨密度檢測(cè)數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件t檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01有顯著差異。LC-MS所收集到的RAW文件則導(dǎo)入Protein Discovery軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，運(yùn)用SIEVE軟件對(duì)不同組別骨蛋白進(jìn)行相對(duì)定量定性分析。

3 結(jié)果

3.1 二仙湯提高大鼠股骨骨密度

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠股骨密度明顯下降，二仙湯則能提高股骨骨密度，見(jiàn)表2，顯示二仙湯具有防治骨質(zhì)疏松的作用。

3.2 LC-MS總離子流圖

各組樣品總離子流圖譜（TIC），見(jiàn)圖1。與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠樣本的TIC圖從外觀上有一定差異。而與模型組相比較，二仙湯組大鼠樣本的TIC圖也有一定差異。

3.3 股骨差異蛋白質(zhì)的分析

假手術(shù)組、模型組、阿侖膦酸鈉組、二仙湯組股骨共檢測(cè)到1 685個(gè)蛋白。以模型組（M）為對(duì)照，假手術(shù)組（J）、阿侖膦酸鈉組（Y）及二仙湯組（D）與模型組差異蛋白，見(jiàn)表3。

4 討論

本研究采用經(jīng)典的去卵巢方法復(fù)制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，3個(gè)月后發(fā)現(xiàn)骨密度明顯變化，與假手術(shù)組相比，模型組股骨密度平均值顯著降低，提示去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠造模成功。同時(shí)以二仙湯干預(yù)后，股骨密度明顯高于模型組，表明二仙湯能提高去卵巢大鼠骨密度，對(duì)大鼠切除卵巢引起的骨質(zhì)疏松癥有防治作用，與前期研究結(jié)果一致[4]。

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究生物學(xué)過(guò)程和描繪細(xì)胞和組織變化的有效手段。在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學(xué)也是闡釋人類(lèi)疾病病因，發(fā)病機(jī)制和探索藥物作用新靶點(diǎn)的重要工具。本研究中以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為研究手段，從股骨組織的蛋白差異表達(dá)來(lái)分析與二仙湯提高骨密度相關(guān)的蛋白質(zhì)，以說(shuō)明二仙湯防治骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制。差異蛋白生物學(xué)功能探討如下。

4.1 生物氧化相關(guān)蛋白

氧化應(yīng)激與骨質(zhì)疏松癥密切相關(guān)，婦女絕經(jīng)后雌激素水平顯著降低，活性氧（ROS）水平升高誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥，補(bǔ)腎壯骨中藥抗骨質(zhì)疏松主要是通過(guò)對(duì)雌激素水平、鈣磷代謝與氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[7-8]。通過(guò)搜索Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)Molecular Function發(fā)現(xiàn)，碳酸酐酶2具有促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，調(diào)控骨吸收作用，碳酸酐酶3主要參與氧化應(yīng)激反應(yīng)。碳酸酐酶2能夠促進(jìn)CO₂與H₂O反應(yīng)合成H₂CO₃，H₂CO₃釋放游離的H⁺和HCO^-3，H⁺通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)形成H⁺-ATPase，而H⁺-ATPase參與破骨細(xì)胞中的酸性骨基質(zhì)脫礦過(guò)程[9]。Simone Carradori等[10]表明，碳酸酐酶2抑制劑能夠調(diào)控骨形成與骨吸收動(dòng)態(tài)平衡，具有預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的作用。作者前期研究也發(fā)現(xiàn)二仙湯具有抗氧化的作用[4]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組生物氧化相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)。而與模型組相比，二仙湯組生物氧化相關(guān)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)一步提示二仙湯治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制可能與其下調(diào)生物氧化相關(guān)蛋白有關(guān)。

4.2 脂肪酸代謝相關(guān)蛋白

骨質(zhì)疏松以骨量減少和骨結(jié)構(gòu)破壞為特征，并伴隨著骨髓中成骨細(xì)胞/脂肪細(xì)胞比值的改變，脂肪細(xì)胞增多促使脂肪形成，堆積在骨髓腔中抑制骨形成[11]。Sok Kuan Wong等表明[12]，脂代謝紊亂與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)，肥胖模型大鼠股骨和脛骨的骨礦物質(zhì)含量與骨小梁參數(shù)較正常大鼠顯著下降，脂肪組織中含有大量的激素和炎癥細(xì)胞因子，例如白介素-1β（IL-1β），白介素-6 （IL-6），C-反應(yīng)蛋白 （CRP），瘦素和脂聯(lián)素，促炎癥細(xì)胞因子通過(guò)刺激RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和骨吸收。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組脂肪酸代謝相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明模型組脂肪酸代謝受阻。而與模型組相比，二仙湯組脂肪酸代謝相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，提示二仙湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸代謝，促進(jìn)脂肪酸的氧化，減少脂質(zhì)堆積達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的。

4.3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白

Catherine D等[13]研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)-整合素構(gòu)成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)于成骨細(xì)胞分化和礦化結(jié)節(jié)的形成是至關(guān)重要的，整合素β₁的表達(dá)水平上升能增強(qiáng)成骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合能力，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、形態(tài)及功能，促使成骨細(xì)胞分化成熟。搜索Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)Molecular Function發(fā)現(xiàn)，酪氨酸蛋白激酶SYK參與NF-κB，MAPK等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響破骨細(xì)胞的分化成熟與功能發(fā)揮，具有調(diào)控骨吸收作用。酪氨酸蛋白激酶SYK的缺失會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂，使骨吸收功能下降[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組整合素β₁蛋白表達(dá)下調(diào)，酪氨酸蛋白激酶SYK表達(dá)上調(diào)。而與模型組相比，二仙湯組整合素β₁蛋白表達(dá)上調(diào)，酪氨酸蛋白激酶SYK表達(dá)下調(diào)，提示二仙湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞的增殖分化。

4.4 細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組肌球蛋白-10、肌球蛋白-11、膜聯(lián)蛋白A1、絲切蛋白-1等蛋白表達(dá)下調(diào)，表明模型組大鼠細(xì)胞骨架蛋白遭到破壞。而與模型組相比，二仙湯組肌球蛋白-10、肌球蛋白-11、膜聯(lián)蛋白A1、絲切蛋白-1等蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，提示二仙湯能夠調(diào)節(jié)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠細(xì)胞骨架蛋白，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

綜上所述，二仙湯具有防治骨質(zhì)疏松的作用。以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)骨組織進(jìn)行分析，初步確認(rèn)二仙湯干預(yù)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠后股骨組織的差異蛋白，如碳酸酐酶2、整合素β1等，這些差異蛋白質(zhì)可能是二仙湯防治骨質(zhì)疏松癥的靶點(diǎn)蛋白，也將在今后的研究中進(jìn)一步對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Zhang H W，Recker R，Lee W P，et al.Proteomics in bone research[J].Expert Rev Proteomics，2010，7（1）：103.

[2] 董冰峰，方肇勤.二仙湯實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2003，9（10）：78.

[3] 李旭斌，王桂敏.二仙湯對(duì)去勢(shì)后大鼠骨質(zhì)疏松的影響研究[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（15）：2960.

[4] 劉波，陳明，李?yuàn)檴?，?二仙湯對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的影響[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2014，20（2）：129.

[5] 朱宇偉，于慶云，劉培，等.蛋白質(zhì)組學(xué)在中醫(yī)藥科學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2016，18（5）：661.

[6] 謝肇，李起鴻，孟萍，等.去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型的特點(diǎn)[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10（28）：79.

[7] Cervellati C，Bonaccorsi G，Cremonini E，et al.Oxidative stress and bone resorption interplay as a possible trigger for postmenopausal osteoporosis[J]. Biomed Res Int，2014， 2014 （2004） ：569563.

[8] 李燁，童杰，周衍晶，等.補(bǔ)腎壯骨中藥抗骨質(zhì)疏松有效成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40（6）：1038.

[9] Chen J，He H C，Xia Q J，et al.Effects of pulsed electromagnetic fields on the mRNA expression of RANK and CAII in ovariectomized rat osteoclast-like cell[J].Connect Tissue Res，2010，51（1）：1

[10] Carradori S，Mollica A，Celeste D M，et al.Nitric oxide donors and selective carbonic anhydrase inhibitors： a dual pharmacological approach for the treatment of glaucoma， cancer and osteoporosis[J].Molecules，2015， 20（4）：5667.

[11] Idris A I，Sophocleous A，Landao B E，et al. Cannabinoid receptor type 1 protects against age-related osteoporosis by regulating osteoblast and adipocyte differentiation in marrow stromal cells[J]. Cell Metab，2009，10（2）：139.

[12] Wong S K，Chin K Y，Suhaimi F H，et al.The relationship between metabolic syndrome and osteoporosis： a review[J]. Nutrients， 2016，8（6）： 347.

[13] Reyes C D，Garcia A J.Alpha-2 beta-1 integrin-specific collagen-mimetic surfaces supporting osteoblastic differentiation[J].J Biomed Mater Res A，2004，69（4）：591.

[14] Zou W，Kitaura H，Reeve J，et al.Syk， c-Src， the αvβ3 integrin， and ITAM immunoreceptors， in concert， regulate osteoclastic bone resorption[J]. J Cell Biol，2007，176（6）：877.

[責(zé)任編輯 張寧寧]