王緒楠+李祥+陳勇+李月

[摘要] 研究12種番荔枝內(nèi)酯類化合物對耐阿霉素肝癌細(xì)胞SMMC-7721/ADR的作用，并初步探究其構(gòu)效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測12種番荔枝內(nèi)酯類化合物：annosquamin A（1），annosquamin B（2），annotemoyin-1（3），uvariamicin Ⅱ（4），annosquacin D（5），annosquacin B（6），isodesacetyluvaricin（7），uvarigrandin A（8），squamostatin D（9），squamostatin E（10），squamostatin A（11），12，15-cis-squamostatin A（12）對SMMC-7721/ADR細(xì)胞中相關(guān)基因NDUFV2的表達(dá)量。該研究發(fā)現(xiàn)所有受試化合物均使SMMC-7721/ADR中NDUFV2表達(dá)量有所下調(diào)，鄰雙四氫呋喃環(huán)型番荔枝內(nèi)酯活性最強(qiáng)，而間雙四氫呋喃環(huán)型番荔枝內(nèi)酯活性最弱。內(nèi)酯環(huán)與鄰近的四氫呋喃環(huán)間碳數(shù)越少，作用越強(qiáng)；對于鄰雙四氫呋喃型番荔枝內(nèi)酯化合物，鏈上含有的羥基個(gè)數(shù)越多，化合物作用可能越強(qiáng)；對于間雙四氫呋喃型番荔枝內(nèi)酯化合物，鏈上含有的羥基個(gè)數(shù)越少，化合物作用可能越強(qiáng)；且受試化合物中均是含有3個(gè)羥基取代的化合物作用較強(qiáng)；相對構(gòu)型為蘇式的番荔枝內(nèi)酯的作用比赤式的強(qiáng)，四氫呋喃環(huán)為順式構(gòu)型的番荔枝內(nèi)酯的作用比反式的強(qiáng)；在其他基團(tuán)完全相同的情況下，長鏈烷基端部與鄰近的四氫呋喃環(huán)之間的碳數(shù)越少，作用越強(qiáng)。

[關(guān)鍵詞] 番荔枝內(nèi)酯；多藥耐藥；SMMC-7721/ADR；構(gòu)效關(guān)系

[Abstract] The present research was launched to investigate the effects of 12 annonaceous acetogenins （ACGs） on human hepatic carcinoma cell line SMMC-7721/ADR， and to find out their structure-activity relationship. SMMC-7721/ADR cells were treated with 12 ACGs including annosquamin A（1），annosquamin B（2），annotemoyin-1（3），uvariamicin Ⅱ（4），annosquacin D（5），annosquacin B（6），isodesacetyluvaricin（7），uvarigrandin A（8），squamostatin D（9），squamostatin E（10），squamostatin A（11），and 12，15-cis-squamostatin A（12） for 24 h， and the different expression of the target gene NDUFV2 were detected by quantitative real-time PCR. All the tested compounds made the expression of the target gene NDUFV2 decreased on human hepatic carcinoma cell line SMMC-7721/ADR， of which the bistetrahydrofuran ACGs showed the best activity，which the non-adjacent bistetrahydrofuran ACGs displayed the worst activity.The ACGs with the reducing number of carbons between γ-unsaturated lactone and the close tetrahydrofuran （THF） ring are more potent. For bistetrahydrofuran ACGs with the same nucleus skeleton，they would be more active as more hydroxyls on aliphatic chain， which for the non-adjacent bistetrahydrofuran ACGs with less hydroxyls on aliphatic chain that would be more active. ACGs with 3 hydroxyls on aliphatic chain would be more active. ACGs with threo configuration are more active than erythro configurotion， and the compounds with cis THF ring seem to be superior to those of trans THF ring. Furthermore， the ACGs with the reducing number of carbons between terminal methyl and the close tetrahydrofuran （THF） ring are more potent.

[Key words] annonaceous acetogenins；multidrug resistance；SMMC-7721/ADR；structure-activity relationship

番荔枝Annona squamosal L.為番荔枝科Annonaceae番荔枝屬Annona植物，廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，我國的廣東、廣西、云南及海南等南方多數(shù)城市均有栽培[1]，據(jù)《中華本草》[2]記載：番荔枝科番荔枝屬植物番荔枝的干燥成熟種子，性味苦、寒，歸心、肺、肝、腎、脾經(jīng)，其功效為消積殺蟲、清熱解毒、解郁、止血。番荔枝內(nèi)酯是從番荔枝科植物中提取分離得到的一類長鏈內(nèi)酯類化合物，其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為35～37個(gè)碳原子構(gòu)成的化合物骨架，分子中含0～3個(gè)四氫呋喃環(huán)（tetrahydrofuran，THF），末端有1個(gè)甲基取代或經(jīng)重排的γ-內(nèi)酯環(huán)和2條連接這些部分的長烷基直鏈，在碳鏈上還常常帶有一些立體化學(xué)多變的含氧官能團(tuán)（羥基、酮基、乙酰氧基、環(huán)氧結(jié)構(gòu)等）或者雙鍵[3-6]。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道，番荔枝內(nèi)酯具有顯著的抗腫瘤作用，尤其是對抑制多藥耐藥腫瘤細(xì)胞的生長[7]表現(xiàn)出強(qiáng)烈的活性。對線粒體的強(qiáng)效抑制作用[8]，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]，殺死腫瘤細(xì)胞為其作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)前期采用體外線粒體復(fù)合酶Ⅰ活性測試、計(jì)算機(jī)模擬分子對接兩種方法，以AGGs對線粒體復(fù)合酶Ⅰ的NDUFV2亞基模擬對接，發(fā)現(xiàn)AGGs能夠與線粒體復(fù)合酶Ⅰ的NDUFV2亞基結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行很好結(jié)合，為進(jìn)一步驗(yàn)證AGGs對該亞基的作用，結(jié)合番荔枝內(nèi)酯立體結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其構(gòu)效關(guān)系研究[10]已經(jīng)成為現(xiàn)代研究的一大熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選用實(shí)驗(yàn)室前期分離得到的 12個(gè)番荔枝內(nèi)酯類化合物，選用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，主要考察結(jié)構(gòu)中γ-內(nèi)酯環(huán)兩環(huán)間與鄰近的四氫呋喃環(huán)的碳數(shù)、羥基個(gè)數(shù)、四氫呋喃環(huán)及相鄰羥基的構(gòu)型、長鏈烷基端部與鄰近的四氫呋喃環(huán)之間的碳數(shù)等因素對SMMC-7721/ADR上目的基因NDUFV2的作用之間的關(guān)系，以期進(jìn)一步探索番荔枝內(nèi)酯對抗腫瘤作用的機(jī)制，并為臨床治療找到一種具有高活性抗多藥耐藥性腫瘤的化合物結(jié)構(gòu)模型。

1 材料

12個(gè)番荔枝內(nèi)酯化合物annosquamin A（1），annosquamin B（2），annotemoyin-1（3），uvariamicin Ⅱ（4），annosquacin D（5），annosquacin B（6），isodesacetyluvaricin（7），uvarigrandin A（8），squamostatin D（9），squamostatin E（10），squamostatin A（11），12，15-cis-squamostatin A（12）（表1，圖1）均為本實(shí)驗(yàn)前期分離得到，經(jīng)HPLC-DAD檢測，HPLC純度均>98%。順鉑（齊魯制藥有限公司）；紫杉醇（北京華素制藥有限公司）；阿霉素（浙江海正藥企有限公司）；Trizol試劑（南京卡羅登生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green染料（TOYOBO，日本）；SMMC-7721/ADR細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞、RPMI 1640 培養(yǎng)基（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；DEPC水、胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司）；胰蛋白酶（Biosharp公司，美國）；噻唑藍(lán)（MTT）、PBS磷酸鹽緩沖溶液、EDTA（北京索來寶科技有限公司）；乙醇、二甲基亞砜（DMSO）（分析純，無錫海碩生物有限公司）；丙酮、氯仿（江蘇漢邦有限公司）。

超凈臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2F）；CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific HE-RA cell 150i，美國）；酶標(biāo)儀（Spectra MAX190，Molecular Devices，美國）；超微量核酸蛋白測定儀（NanoDrop，美國）；定量PCR儀qTOWER 2.0（耶拿，德國）。

2 方法

2.1 SMMC-7721/ADR細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞的培養(yǎng)

SMMC-7721/ADR細(xì)胞株培養(yǎng)于在含20 mg·L^-1阿霉素、10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素混合液的RPMI 1640培養(yǎng)基中1周，再培養(yǎng)于不含阿霉素的培養(yǎng)液中2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于在10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素混合液的RPMI 1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞置于CO₂培養(yǎng)箱中，在37 ℃和5% CO₂條件下培養(yǎng)。

2.2 MTT法驗(yàn)證細(xì)胞的多藥耐藥性

取對數(shù)生長期細(xì)胞SMMC-7721/ADR和SMMC-7721，確定活細(xì)胞數(shù)大于90%。用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104 個(gè)/mL接種于96孔板，200 μL/孔，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)。將細(xì)胞分為對照組（細(xì)胞用培養(yǎng)基培養(yǎng)）、給藥組（細(xì)胞分別用不同濃度梯度的紫杉醇、阿霉素、順鉑培養(yǎng)），SMMC-7721/ADR細(xì)胞給藥組的濃度梯度分別為阿霉素（700，350，175，87.5，43.75，21.875，10.937 5，5.468 75，2.734 375 mg·L^-1），紫杉醇（171，85.5，42.75，21.375，10.687 5，5.343 75，2.671 875，1.335 938，0.667 969 mg·L^-1），順鉑（725，362.5，181.25，90.625，45.312 5，22.656 25，11.328 13，5.664 063，2.832 203 1 mg·L^-1）。SMMC-7721細(xì)胞給藥組的濃度梯度分別為阿霉素（700，350，175，87.5，43.75，21.875，10.937 5，5.468 75，2.734 375 mg·L^-1），紫杉醇（85.5，42.75，21.375，10.687 5，5.343 75，2.671 875，1.335 938，0.667 969，0.333 984 mg·L^-1），順鉑（725，362.5，181.25，90.625，45.312 5，22.656 25，11.328 13，5.664 063，2.832 203 1 mg·L^-1）。將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，吸出上清液，對照組加入200 μL/孔培養(yǎng)基，給藥組加入200 μL/孔含各濃度梯度的紫杉醇、阿霉素、順鉑的培養(yǎng)基，然后將96孔板置于37 ℃，5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。隨后每孔加入5 g·L^-1 MTT試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。輕輕吸出96孔板中培養(yǎng)液，加入DMSO，150 μL/孔，震蕩搖勻10 min，使結(jié)晶物充分溶解，并在490 nm波長處用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度（A）。采用直線回歸法計(jì)算藥物對SMMC-7721/ADR細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞抑制率=（1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照組）×100%

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

取對數(shù)生長期細(xì)胞SMMC-7721/ADR確定活細(xì)胞數(shù)大于90%。用RPMI 1640培養(yǎng)液將細(xì)胞接種于直徑10 cm為培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞分為對照組（細(xì)胞用培養(yǎng)基處理）和給藥組（細(xì)胞用10 μmol·L^-1的不同番荔枝內(nèi)酯的培養(yǎng)基處理），培養(yǎng)24 h，將上清液吸出，對照組加入10 mL培養(yǎng)基，給藥組加入10 mL含不同番荔枝內(nèi)酯的培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)皿置于37 ℃，5% CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上清液，加入10 mL PBS，輕輕振蕩，清洗細(xì)胞后棄去液體，加入1 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞，按照Trizol提取細(xì)胞總RNA 方法說明書提取總RNA。使用Nonodrop超微量核酸檢測儀測定RNA濃度和純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明書合成cDNA，將合成的cDNA取2 μL按照SYBR Green摻入法配成20 μL反應(yīng)體系，以HMBS為內(nèi)參，NDUFV2為目的基因，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，進(jìn)行50個(gè)PCR循環(huán)。熔解曲線：60 ℃以每秒升高5 ℃至95 ℃，95 ℃6 s。qPCR最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，ΔΔCT=（CtmiRNA-CtHMBS）給藥組-（CtmiRNA-CtHMBS）對照組（表2）。

3.2.1 內(nèi)酯環(huán)與鄰近的四氫呋喃環(huán)間的碳數(shù)對化合物活性的影響 四氫呋喃環(huán)與內(nèi)酯環(huán)間的碳數(shù)對化合物作用有較大影響。化合物1與2，化合物5與6的相對分子質(zhì)量、THF的類型、相對構(gòu)型、OH數(shù)均相同，它們僅在四氫呋喃環(huán)與γ-內(nèi)酯環(huán)之間的碳原子數(shù)不同。單四氫呋喃型番荔枝內(nèi)酯化合物中，化合物1（2環(huán)間碳數(shù)為 7個(gè)）的下調(diào)大于化合物2（2環(huán)間碳數(shù)為 9個(gè)）。此外，鄰雙四氫呋喃型番荔枝內(nèi)酯化合物中，化合物6（2環(huán)間碳數(shù)為9個(gè)）的下調(diào)大于化合物5（2環(huán)間碳數(shù)為11個(gè)），由此推測，該類化合物結(jié)構(gòu)中，四氫呋喃環(huán)與內(nèi)酯環(huán)間碳數(shù)越少，化合物的作用可能越強(qiáng)。

3.2.2 取代羥基個(gè)數(shù)對化合物活性的影響 取代羥基個(gè)數(shù)對化合物作用有較大影響。鄰雙四氫呋喃型番荔枝內(nèi)酯化合物7與8的四氫呋喃環(huán)與內(nèi)酯環(huán)之間的碳原子數(shù)相同、相對構(gòu)型相同，它們僅在羥基的個(gè)數(shù)上有所不同?；衔?（有3個(gè)羥基）的下調(diào)大于化合物7（有2個(gè)羥基）。間雙四氫呋喃型番荔枝內(nèi)酯化合物9與11的四氫呋喃環(huán)與內(nèi)酯環(huán)之間的碳原子數(shù)相同、相對構(gòu)型相同，僅在羥基的個(gè)數(shù)上有所不同，化合物9（有3個(gè)羥基）下調(diào)大于化合物11（有4個(gè)羥基）。由此推測，對于鄰雙四氫呋喃型番荔枝內(nèi)酯化合物，鏈上含有的羥基個(gè)數(shù)越多，化合物作用可能越強(qiáng)；對于間雙四氫呋喃型番荔枝內(nèi)酯化合物，鏈上含有的羥基個(gè)數(shù)越少，化合物作用可能越強(qiáng)；且受試化合物中均是含有3個(gè)羥基取代的化合物作用較強(qiáng)。

3.2.3 四氫呋喃環(huán)及鄰位羥基構(gòu)型對化合物活性的影響 四氫呋喃環(huán)的構(gòu)型對化合物的作用也有較大的影響?；衔?和10，化合物11和12僅在四氫呋喃環(huán)的構(gòu)型上略有不同，間雙型四氫呋喃環(huán)番荔枝內(nèi)酯類化合物中，化合物10（構(gòu)型為trans/threo-threo/trans/threo）的下調(diào)比化合物9（構(gòu)型為trans/threo-threo/trans/erythro）的多。由此推測，具有蘇式構(gòu)型的番荔枝內(nèi)酯類化合物的作用比具有赤式構(gòu)型的番荔枝內(nèi)酯類化合物作用強(qiáng)。化合物12（構(gòu)型為cis/threo-threo/trans/erythro）的下調(diào)比化合物11（構(gòu)型為trans/threo-threo/trans/erythro）要多。由此推測，四氫呋喃環(huán)為順式構(gòu)型的番荔枝內(nèi)酯類化合物作用比反式的強(qiáng)。

3.2.4 長鏈烷基端部與鄰近的四氫呋喃環(huán)之間的碳數(shù)對化合物活性的影響 四氫呋喃環(huán)與長鏈烷基端部之間的碳數(shù)對化合物作用有一定的影響。在單四氫呋喃環(huán)型番荔枝內(nèi)酯類化合物中，化合物3和4的四氫呋喃環(huán)與內(nèi)酯環(huán)間的碳數(shù)，取代羥基位置、個(gè)數(shù)，四氫呋喃環(huán)及其相鄰的取代羥基相對構(gòu)型都相同，不同之處在于四氫呋喃環(huán)與長鏈烷基端部之間的碳數(shù)不同，化合物3（碳數(shù)為12個(gè)）的下調(diào)比化合物4（碳數(shù)為14個(gè)）強(qiáng)，由此推測，在其他基團(tuán)完全相同的情況下，四氫呋喃環(huán)與長鏈烷基端部之間的碳數(shù)越少，化合物作用越強(qiáng)（表4～6，圖2～4）。

4 討論

通過上述番荔枝內(nèi)酯類化合物對SMMC-7721/ADR細(xì)胞中NDUFV2的影響表明：①所有受試化合物均使SMMC-7721/ADR中NDUFV2表達(dá)量有所下調(diào)，鄰雙四氫呋喃環(huán)型番荔枝內(nèi)酯活性最強(qiáng)，而間雙四氫呋喃環(huán)型番荔枝內(nèi)酯活性最弱；②內(nèi)酯環(huán)和鄰近的四氫呋喃環(huán)間碳數(shù)越少，活性越強(qiáng)；③對于鄰雙四氫呋喃型番荔枝內(nèi)酯化合物，鏈上含有的羥基個(gè)數(shù)越多，化合物作用可能越強(qiáng)；對于間雙四氫呋喃型番荔枝內(nèi)酯化合物，鏈上含有的羥基個(gè)數(shù)越少，化合物作用可能越強(qiáng)，且受試化合物中均是含有3個(gè)羥基取代的化合物作用較強(qiáng)；④相對構(gòu)型為蘇式的番荔枝內(nèi)酯的活性比赤式的強(qiáng)，四氫呋喃環(huán)為順式構(gòu)型的番荔枝內(nèi)酯的活性比反式的強(qiáng)；⑤在其他基團(tuán)完全相同的情況下，長鏈烷基端部與鄰近的四氫呋喃環(huán)之間的碳數(shù)越少，活性越強(qiáng)。結(jié)合以上研究，可以為合成高活性抗腫瘤多藥耐藥的番荔枝內(nèi)酯類化合物提供理論依據(jù)。

化合物8分子式為C₃₇H₆₆O₇，含有3個(gè)羥基取代，構(gòu)型為th/t/th/t/th，四氫呋喃環(huán)和內(nèi)酯環(huán)之間碳數(shù)位13個(gè)的鄰雙四氫呋喃環(huán)型番荔枝內(nèi)酯，其對SMMC-7721/ADR細(xì)胞中NDUFV2表達(dá)下調(diào)最為顯著，結(jié)合實(shí)驗(yàn)構(gòu)效分析結(jié)構(gòu)，本文設(shè)想了1個(gè)化合物結(jié)構(gòu)：總碳原子數(shù)為37，羥基數(shù)為3個(gè)，四氫呋喃環(huán)與內(nèi)酯環(huán)間碳數(shù)為7個(gè)，THF環(huán)與鄰位羥基的構(gòu)型為th/c/th/c/th，該化合物可能會對SMMC-7721/ADR細(xì)胞中NDUFV2表達(dá)下調(diào)產(chǎn)生更為顯著的影響，化合物結(jié)構(gòu)（圖5）。

由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，番荔枝內(nèi)酯對耐藥細(xì)胞抑制活性的影響因素主要包括四氫呋喃環(huán)與內(nèi)酯環(huán)間的碳數(shù)、取代羥基個(gè)數(shù)、四氫呋喃環(huán)構(gòu)型、四氫呋喃環(huán)與長鏈烷基端部之間的碳數(shù)等方面。然而，考慮到立體化學(xué)的復(fù)雜、多變，這些因素并非單獨(dú)作用，而是相互影響，綜合作用。各因素的影響力度也不一樣，這可能與各因素導(dǎo)致番荔枝內(nèi)酯化合物與受體的結(jié)合程度不同有關(guān)[11]。同時(shí)，這也是該類化合物首次被報(bào)導(dǎo)參與線粒體復(fù)合酶Ⅰ蛋白的連接，這為后期用于研究逆轉(zhuǎn)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞機(jī)制研究提供了一定的依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]