龐建云+劉肖+申寶德+沈成英+連王權+劉娟+胡春曉+鐘芮娜+許潤春+袁海龍

[摘要] 為增加異補骨脂素的皮膚透過量及滯留量，提高其生物利用度。該文采用高壓均質(zhì)法制備異補骨脂素納米結構脂質(zhì)載體（IPRN-NLC），以包封率、載藥量及平均粒徑為評價指標，運用正交實驗優(yōu)化最佳處方。采用Franze擴散池法考察IPRN-NLC的體外透皮。結果表明，最優(yōu)處方固液脂質(zhì)比為7∶3，藥脂比1∶30，表面活性劑1%，制備的IPRN-NLC平均包封率為（90.25±0.73）%，平均載藥量為（1.56±0.27）%，平均粒徑為（305±1.57） nm；體外透皮實驗顯示IPRN-NLC提高了IPRN的皮膚透過量，且皮膚滯留量是IPRN（水）溶液的3倍。采用高壓均質(zhì)法制備的IPRN-NLC提高了IPRN的皮膚透過量及滯留量，在經(jīng)皮給藥領域具有廣闊的應用前景。

[關鍵詞] 異補骨脂素；納米結構脂質(zhì)載體；體外透皮；皮膚滯留量

[Abstract] To increase the permeation and retention of isopsoralen in skin， and improve its bioavailability.Isopsoralen loaded nanostructure liquid carrier （IPRN-NLC） was prepared by high pressure homogenization andoptimized by orthogonal experiment with the encapsulation efficiency， drug loading and average particle size as the evaluation indexes. The in vitro transdermal permeation of IPRN-NLC was evaluated by Franze diffusion cells.The results showed that solid-liquid lipid ratio of optimum IPRN-NLC formulation was 7∶3，drug-lipid ratio of 1∶30， 1% surfactant. Under these conditions， IPRN-NLC had an average encapsulation of （90.25±0.73）%，drug loading of （1.56±0.27）% and an average particle size of （305±1.57） nm.The in vitro transdermal permeation results showed that IPRN-NLC could increase the amount of IPRN permeated though skin， with 3 times of the epidermal retention as compared with IPRN solution. From the results we can know that the IPRN-NLC prepared by high pressure homogenization can improve the permeation andaccumulation of IPRN in the skin， with wide application prospects in the field of transdermal administration.

[Key words] isopsoralen；nanostructured lipid carrier；in vitro transdermal permeation；skin retention

白癜風是由皮膚和毛囊處的黑素細胞內(nèi)酪氨酸酶的功能減退、喪失所引起的一種常見的色素障礙性皮膚疾病[1]。黑色素合成減少是白癜風發(fā)病的直接原因，而酪氨酸酶是皮膚黑素生物合成的關鍵酶，因此提高酪氨酸酶的活性是治療白癜風的關鍵[2]。補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實，可用于治療白癜風、斑禿、牛皮癬以及瘤樣皮膚病[3-5]。補骨脂中香豆素類成分異補骨脂素（isopsoralen，IPRN）具有光敏性，可以提高酪氨酸酶的活性，促進黑色素合成，是治療白癜風的主要藥效成分[6]。然而，IPRN為難溶性物質(zhì)，不易透皮且在皮膚表皮層滯留量少，生物利用度低，嚴重制約了其在皮膚領域的應用。

納米結構脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carriers，NLC）是從固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）發(fā)展而來的一種新型納米給藥系統(tǒng)[7-8]。NLC是將差異較大的液體脂質(zhì)加到固體脂質(zhì)中，增加晶體的混亂度，為藥物提供更多容納空間，不僅提高了載藥量，還避免了放置過程中藥物泄漏、包封率的降低，提高了藥物的穩(wěn)定性[9-10]。同時，NLC具有良好的皮膚黏附性，覆蓋于皮膚后會在皮膚表面形成一層稠密的薄膜，發(fā)揮水合效應，從而促進藥物的透皮吸收，提高了藥物的生物利用度，因此NLC是經(jīng)皮給藥的一種良好的載體，越來越受到廣泛的關注[11]。

為增加其在皮膚的滯留量，提高藥物的生物利用度，充分發(fā)揮藥物的療效，本實驗采用高壓均質(zhì)法將IPRN制成納米結構脂質(zhì)載體，通過正交試驗優(yōu)化處方，并對IPRN-NLC的體外透皮性能進行評價。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；TB-215D電子天平（1/10 萬，丹佛儀器（北京有限公司）；恒溫磁力攪拌器（DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器）；Winner802納米激光粒度儀（濟南微納有限公司）；TP-6智能透皮試驗儀（天津市鑫洲科技有限公司）

IPRN原料藥（質(zhì)量分數(shù)98%，陜西金泰生物工程有限公司，批號xh20160415），IPRN對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110738-201614），單硬脂酸甘油酯（GMS，阿法埃莎化學有限公司），Miglyol 812（廣州威?；び邢薰?，批號150420），山崳酸甘油酯（ATO888，法國嘉法獅，批號158355），大豆磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司，批號20150201），中碳鏈三甘酯（MCT，北京風禮精求商貿(mào)有限責任公司，批號24561），聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40（北京風禮精求商貿(mào)有限責任公司，批號19049768EO），蓖麻油（天津市光復精細化工研究所，批號141120），色譜甲醇、乙腈，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定的方法學建立

2.1.1 色譜條件

Kromasil 100-5C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm，82592），柱溫25 ℃，流動相為乙腈-0.1%磷酸水（38∶62），檢測波長246 nm，體積流量1.0 mL·min^-1，進樣量10 μL。

2.1.2 溶液的配制

2.1.2.1 供試品溶液的配制 精密量取1 mL IPRN-NLC至10 mL量瓶中，加甲醇破乳并定容至刻度，1萬 r·min^-1離心10 min，0.45 μm的微孔濾膜濾過后即得IPRN-NLC供試品溶液；同法制得空白NLC供試品溶液。

2.1.2.2 對照品貯備液的制備 精密稱取IPRN對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度線，即得0.404 g·L^-1的IPRN對照品儲備液，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 專屬性考察

分別取對照品溶液、供試品溶液，在上述色譜條件下分別進樣10 μL，記錄色譜圖，結果見圖1。IPRN-NLC的保留時間與對照品保留時間一致，在該檢測條件下，空白NLC對IPRN的含量測定無干擾。

2.1.4 線性關系考察

精密吸取IPRN對照品貯備液適量，用甲醇分別配置成質(zhì)量濃度為1.617，8.085，16.17，24.255，32.34 mg·L^-1 IPRN溶液。按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積。以IPRN的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得線性回歸方程Y=8 613.509 16X-0.091 94，R²=0.999 9，結果表明IPRN在1.617～32.34 mg·L^-1線性關系良好。

2.1.5 精密度考察

精密吸取質(zhì)量濃度為16.17 mg·L^-1的IPRN對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣，平行測定6次，計算精密度。結果精密度的RSD為0.22%，表明儀器的精密度良好。

2.1.6 重復性考察

按照2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液進樣檢測，記錄峰面積，計算RSD。重復性RSD為0.080%（n=6），表明該試驗方法重復性較好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗

取2.1.2項下的IPRN-NLC供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h進樣測定，記錄峰面積。結果RSD為0.36%，表明IPRN-NLC供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 回收率測定

精密吸取0.6，0.8，1.0 mL IPRN對照品溶液于10 mL量瓶中，分別加入0.5 mL空白NLC，加甲醇超聲破乳0.5 h后定容至刻度線，即得質(zhì)量濃度分別為0.970 2，1.293 6，1.617 mg·L^-1供試品溶液。按2.1.1項色譜條件進樣，分別測定3次，計算回收率。測得平均回收率分別為101.2%，98.62%，100.9%，RSD分別為0.65%，0.35%，0.33%，表明該方法回收率良好，制劑輔料對IPRN的測定無影響。

2.2 IPRN在不同固液脂質(zhì)中溶解度的測定

測定IPRN在不同液體脂質(zhì)、固體脂質(zhì)中的溶解度。取過量IPRN原料藥于安瓿瓶中，分別加入5 mL Miglyol 812、油酸、蓖麻油、MCT、橄欖油、礦物油，混勻，置恒溫磁力攪拌器中，1 200 r·min^-1攪拌24 h后，5 000 r·min^-1離心10 min，取100 μL上清液于10 mL量瓶中，甲醇定容，過0.45 μm微孔濾膜，進行HPLC分析。分別將相同質(zhì)量的不同固體脂質(zhì)分別加熱到75 ℃后，在攪拌的條件下向熔融基質(zhì)中加入過量的IPRN，IPRN在不同脂質(zhì)中的溶解度見表1。結果表明，IPRN在MCT和ATO888中溶解度較大，且MCT和ATO888有較強的親和力，故選擇MCT為液體脂質(zhì)，ATO888為固體脂質(zhì)。

2.3 IPRN-NLC的制備

2.3.1 高壓均質(zhì)法制備IPRN-NLC

采用高壓均質(zhì)法制備IPRN-NLC[12]。精密稱取處方量ATO888，MCT于77 ℃水浴加熱到熔融狀態(tài)，再加入IPRN原料藥35 mg，攪拌混勻溶解后作為油相。另稱取處方量聚氧乙烯氫化蓖麻油RH40、大豆卵磷脂于100 mL燒杯中，加入70 mL蒸餾水，水浴加熱至與油相相同的溫度，作為水相。在77 ℃條件下，用1 mL注射器將水相緩慢勻速注入到攪拌速度為1 200 r·min^-1的油相中，繼續(xù)攪拌0.5 h，將得到的初乳在1萬 r·min^-1下高速剪切3次，每次1 min，然后在88 MPa條件下，高壓均質(zhì)循環(huán)6次，在室溫下冷卻，即得IPRN-NLC。同法制得不含IPRN的空白NLC。

2.3.2 粒徑及多分散指數(shù)（PI）的測定

在室溫條件下取IPRN-NLC 適量，經(jīng)過稀釋后，采用Winner-802納米激光粒度儀測定IPRN-NLC的粒徑及PI，測定溫度25 ℃（n=3）。

2.3.3 包封率及載藥量的測定

本實驗采用超濾離心法測定IPRN-NLC的包封率和載藥量。精密量取IPRN-NLC分散液0.5 mL，置3萬截留相對分子質(zhì)量的離心超濾管內(nèi)管中，于1萬 r·min^-1離心10 min，外管濾液置于2 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，按HPLC條件進行測定含藥量，為W離。另取0.5 mL分散液置10 mL量瓶內(nèi)，甲醇超聲破乳30 min，定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜，按HPLC條件進行測定含藥量，為W總。包封率和載藥量計算如下。

包封率 =（W總-W游）/W總×100%

載藥量 =（W總-W游）/（W脂質(zhì)總量+W總-W離）×100%

式中，W總為異補骨脂素納米脂質(zhì)載體分散液中的總藥量，W游為游離藥物量，W脂質(zhì)總量為固體脂質(zhì)及液體脂質(zhì)的總量。

2.3.4 IPRN-NLC處方優(yōu)化

2.3.4.1 試驗設計 在單因素考察結果的基礎上，選擇藥脂比（A）、固液脂質(zhì)比（B）、表面活性劑濃度（C）為考察因素，以粒徑、載藥量及包封率為評價指標，采用L9（34）正交實驗優(yōu)化IPRN-NLC處方。因本實驗為多評價指標的優(yōu)化試驗，包封率及載藥量越大越好，而粒徑較小時為好，因此，利用綜合評分法，將各指標統(tǒng)一綜合考察。L9（34）正交試驗因素水平表見表2，結果見表3，以載藥量，包封率和粒徑為評價指標，利用綜合加權評分法篩選最佳處方。載藥量在制劑中占重要地位，其加權為50；包封率和粒徑次之，分別為30，20，總分為100分，以此分為標準對正交試驗進行綜合加權分析，綜合評分=50×（yi1-y1min）/（y1max-y1min）+30×（yi2-y2min）/（y2max-y2min）+20×（yi3-y3min）/（y3max-y3min）。

方差分析見表4，結果表示，極值R反應各因素對實驗結果的影響程度，R越大，影響就越大，

即A>C>B>D，其中各因素水平影響度為A₁>A₃>A₂，B₂>B₃>B₁，C₂> C₃>C₁。藥脂比（A）和表面活性劑濃度（C）對實驗結果有顯著影響（P<0.05），為主要影響因素，固液脂質(zhì)比（B）影響不大。最終確定最優(yōu)處方為A₁B₂C₂，即藥脂比為1∶30，固液脂質(zhì)比為7∶3，表面活性劑的濃度為1%。

2.3.4.2 處方驗證 以最優(yōu)處方制備3批IPRN-NLC，分別測其包封率、載藥量、及粒徑。結果顯示平均包封率為（90.25±0.73）%、載藥量為（1.56±0.27）%、粒徑為（305±1.57） nm，表明具有較好的重復性。

2.3.5 X 射線衍射分析（XRD）

采用X射線衍射（XRD）對IPRN 原料藥、IPRN-NLC、固態(tài)脂質(zhì)ATO888及IPRN的物理混合物進行表征。分別取適量的上述樣品，置于載玻片上壓實后，進行XRD分析，結果見圖2。由圖可知，IPRN在0～40°有多個衍射峰，固體脂質(zhì)ATO888在20～25°有2個衍射峰，與IPRN原料藥XRD圖相比，IPRN物理混合物在0～40°的衍射峰顯著減弱，可能是一部分IPRN已包裹于脂質(zhì)中，而從IPRN-NLC的XRD峰形中可以看出IPRN的衍射峰完全消失，表明IPRN已被包裹于NLC中，以無定型狀態(tài)存在。

2.4 體外透皮試驗

2.4.1 離體皮膚處理方法

取SD大鼠，用10%水合氯醛麻醉后，剃毛，剝離腹部皮膚，小心剔除皮下脂肪和結締組織及血管后，用生理鹽水沖洗干凈，檢查其完整性后即可用。

2.4.2 透皮擴散試驗方法

采用改良的Franz擴散池進行試驗。將制備好的離體皮膚用濾紙吸干表面水分后固定于Franz擴散池的供給池和接受池之間，角質(zhì)層面向供給池。接受池中加入13 mL 含20%乙醇的pH 7.4磷酸鹽緩沖液，在接受池中加入磁力攪拌子并排出氣泡，使皮膚和接受液充分接觸，轉(zhuǎn)速為350 r·min^-1，水浴溫度為（37±0.2）℃，擴散池的有效透皮面積為1.418 cm²。供給池分別注入適量IPRN-NLC和IPRN（水）溶液后開始計時，于0.083，0.25，0.5，0.75，1，2，3，5，7，10，12，24 h從接受池中取樣1 mL，同時補加同溫等量的空白接受液。樣品過0.45 μm濾膜后進樣分析，并計算單位面積的累計透過量（Qt），將Qt對時間t進行線性回歸，即得透皮動力學方程，所得斜率為透皮速率常數(shù)（Js，μg·h^-1·cm-2），Qt的計算公式如下。

Qt=VrCt+t-1i=1VsCiA

式中Qt為t時間的累積透過量，Vr代表接受液的體積（13 mL），Ct為每個取樣點質(zhì)量濃度（g·L^-1），Vs為取樣體積（1 mL），Ci為第i次取樣測得的接受液中藥物濃度，A為擴散滲透面積（cm²）。

體外透皮試驗結束后，分別取下鼠皮，用棉簽輕輕擦拭皮膚表面，以去除殘留藥物，生理鹽水反復沖洗，濾紙吸干水分，剪下有效皮膚面積，并將皮膚剪碎，移入5 mL離心管中，精密加2 mL無水甲醇，渦旋5 min后，超聲30 min，3 000 r·min^-1離心10 min，過0.45 μm濾膜進樣檢測。記錄峰面積，計算IPRN-NLC和IPRN溶液皮膚滯留量。

IPRN溶液及其NLC的透皮結果見圖3，表5。結果表明，IPRN溶液及其NLC的透皮吸收存在顯著性差異，不僅IPRN-NLC 的Q24及Js明顯高于IPRN溶液，且表皮滯留量是IPRN溶液的3倍，說明NLC促進了IPRN的透皮吸收，提高在的皮膚滯留量，有利于藥物充分發(fā)揮療效。

3 討論

在IPRN-NLC的制備過程中，油相和水相的混合時的溫度需要大于混合脂質(zhì)熔點，如果油相加入到水相中，油相會先凝固，使油相分散不均勻，會有較大的粒子形成，而水相加入油相則形成的粒子較均勻，所以本實驗采用水相加入到油相的方法[13]。制備NLC常用的幾種固體脂質(zhì)中，IPRN在GMS和ATO888中溶解度較大，但以GMS為固體脂質(zhì)時，制備的NLC不穩(wěn)定，放置過程中也會產(chǎn)生沉淀，而ATO888制備的NLC具有良好的穩(wěn)定性，且IPRN在ATO888中有較高的溶解度，固本實驗以ATO888為藥物載體。

IPRN-NLC的包封率隨固液脂質(zhì)比的降低先增加后降低，可能因為固體脂質(zhì)減少液體脂質(zhì)適量增加，液體脂質(zhì)擾亂固體脂質(zhì)的固有晶格結構，為藥物提供更多的容納空間，提高藥物的包封率；當固液脂質(zhì)比降為1時，體系中形成納米粒減少，不足以吸附表面活性劑，使多余的表面活性劑形成膠束，增加了藥物在水相中的溶解度，導致包封率和載藥量降低。

透皮實驗研究表明，與IPRN溶液相比，IPRN-NLC顯著增加了藥物的皮膚透過量及在皮膚中的滯留量，可能是NLC可以與皮膚發(fā)生水合作用，進而促進藥物的透皮吸收，也可能是NLC通過毛囊進入皮膚，在皮膚中形成藥庫，然后緩慢釋放藥物。此外，NLC中無刺激性輔料，對皮膚無刺激性，將IPRN包裹于NLC中不僅降低了其對皮膚的刺激性，而且提高了皮膚滯留量，使藥物充分發(fā)揮療效。因此將NLC作為IPRN的載體，應用于新型皮膚局部給藥制劑，具有較大的研究價值。

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[責任編輯 孔晶晶]