何志一+唐先明+劉建輝+袁媛+蔣超+趙玉洋+王洋

[摘要] 該研究依據哈蟆油Cyt b基因155位SNP位點設計位點特異性PCR引物，采用堿裂解法提取基因組DNA，2步循環(huán) PCR 程序進行 PCR 反應，并對PCR反應條件進行優(yōu)化，從而建立起一種哈蟆油及其4種常見混偽品的快速PCR鑒別方法。該方法在90 ℃變性3 s，62 ℃退火延伸20 s進行32個循環(huán)時，加入2 μL 100×SYBR Green Ⅰ染料，正品顯示出明亮綠色熒光，而混淆品不顯示熒光。該方法準確、簡便，40 min內即可完成鑒別，為哈蟆油藥材現場快速鑒定提供技術支持。

[關鍵詞] 快速PCR；哈蟆油；分子鑒定；熒光檢測

[Abstract] Rapid allele-specific PCR primer was designed base on Cytb 155 A/T single nucleotide polymorphism， DNA was extracted by alkaline lysis and the PCR reaction systems including denatured and annealing temperature and cycle numbers were optimized. The results were performed to authenticate Ranae Oviductus and its 4 adulterants. When 100×SYBR Green I was added in the PCR product at 90 ℃ denatured 3 s， 62 ℃ annealing 20 s and 32 cycle. Ranae Oviductus visualized strong green fluorescence under 365 nm UV lamp whereas adulterants appeared negative. The whole process can be completed in 40 minutes.The established method provides the technical support for authentication of the Ranae Oviductus.

[Key words] rapid PCR；Ranae Oviductus；molecular authentication

哈蟆油Ranae Oviductus為蛙科動物中國林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的輸卵管，經采制干燥而得。具有補腎益精，養(yǎng)陰潤肺的功效，用于病后體弱，神疲乏力，心悸失眠，盜汗，癆嗽咳血[1]。是一種集食用藥用于一身的名貴中藥材。由于多方面原因導致哈蟆油嚴重的供不應求，致使偽品充斥于市。目前市場上的偽品哈蟆油主要有黑龍江林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油 4類，其他偽品類型少見[2-3]。2015年版《中國藥典》規(guī)定哈蟆油的鑒別方法為性狀鑒定、高效液相色譜法鑒定及膨脹度測定法，但這些方法易受人為因素、環(huán)境條件或藥材本身的限制，實踐中哈蟆油的鑒定仍感到十分困難。

隨著分子生藥學的發(fā)展，分子鑒定技術在哈蟆油藥材的鑒別中得到不斷的應用[3-6]，很大程度上彌補了傳統(tǒng)鑒別方法的不足。但是，已建立的哈蟆油分子鑒別方法，從模板的提取、PCR 反應到最終結果分析，單個樣品的鑒定步驟繁瑣，耗時長，且需要電泳檢測或序列分析比對，不利于現場快速鑒別的使用。

近年來，快速PCR方法已成功用于金銀花[7]，蛇類[8]，太子參[9]，人參、西洋參[10]等中藥材的真?zhèn)舞b別，因此本項研究基于快速PCR方法對哈蟆油及其常見混偽品（黑龍江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油）進行鑒別研究，有效的提高哈蟆油鑒別反應效率，為哈蟆油藥材的鑒別提供更加符合實際需要、簡便快捷的方法。

1 材料與儀器

1.1 藥材 收集不同產地中國林蛙10批、黑龍江林蛙4批、黑斑蛙4批、中華大蟾蜍4批、牛蛙2批，哈蟆油3批，牛蛙油1批。所有基原動物按傳統(tǒng)加工方法分別制成哈蟆油、黑龍江林蛙油、黑斑蛙油、蟾蜍油、牛蛙油，另選取哈蟆油藥材3批進行快速PCR方法研究。樣品分別采自吉林、黑龍江、遼寧、內蒙古、山東、江蘇、湖南、四川等地。經黑龍江中醫(yī)藥大學中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定，憑證標本保存于哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心，見表1。

1.2 儀器 S1000型梯度PCR儀（Bio-rad公司）；ETC811型PCR儀（東勝興業(yè)科學儀器有限公司）；22R型高速冷凍微量離心機（Beckman公司）；ZH-2型漩渦震蕩器（天津藥典標準儀器廠）；MM400型球磨機（Retsch公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）；310型凝膠成像系統(tǒng)（UVP公司），2000C型分光光度計（NanoDrop公司）。

1.3 試劑 瓊脂糖（西班牙 Biowest Agarose）；GelRed購自 Biotium 公司；SpeedStar HS Taq DNA 聚合酶、rTaq DNA 聚合酶、DL 2000 DNAMarker 購自 TaKaRa 公司；Transfast Taq DNA 聚合酶購自Transgen公司，Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶購自 Vazyme公司；SYBR Green Ⅰ購自 Invitrogen 公司；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 基因組DNA提取及檢測 稱取10 mg研磨好的藥材粉末，使用堿裂解法[11]提取總DNA，采用10%的Chelex-100進行純化，并用超微量分光光度計檢測DNA的濃度及純度。取不同樣品DNA，分別將濃度稀釋為20 mg·L^-1用于PCR反應。選擇通用引物mcb398，mcb869[12]對哈蟆油及其混偽品樣品進行擴增。引物序列及擴增程序見表2。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄，并對PCR產物進行雙向測序。

2.2 基于Cyt b序列的哈蟆油位點特異性鑒別引物設計 從GenBank中下載得到中國林蛙、黑龍江林蛙、黑斑蛙、中華大蟾蜍、牛蛙Cytb序列。測序所得序列使用軟件CodonCode Aligner校對拼接，去除引物區(qū)，將下載和測序獲得序列使用BioEdit軟件進行比對，篩選出哈蟆油基原物種中國林蛙特有的變異位點，根據變異位點使用Primer 5.0軟件進行引物設計，在引物3′末端倒數第二位引入人為錯配。設計出2對鑒別引物，分別命名為155S-F/155S-R（擴增片段約為530 bp），698S-F/698S-R（擴增片段約為105 bp），由Invitrogen 公司合成，序列見表2。

2.3 PCR反應條件優(yōu)化 根據引物的Tm及產物長度設置PCR反應的初始反應條件。取不同樣品DNA用于確定快速PCR反應條件。PCR 反應在 S1000 型PCR儀上進行，反應體系和初始反應程序見表2。反應結束后取PCR 反應產物6 μL，加入 2 μL 6×Loading buffer 混勻后于GelRed染色的 1% 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察、成像。

利用哈蟆油SNP鑒別引物進行快速位點特異性PCR反應，并依次考察退火溫度：65，64，62，61，60 ℃；循環(huán)數：35，32，30，28個循環(huán)；變性溫度：95，90，88，86 ℃；變性時間： 5，3，1 s；退火延伸時間：20，18，16，10 s；引物終濃度：0.1，0.15，0.25 μmol·L^-1；dNTP終濃度：125，200 μmol·L^-1；哈蟆油模板DNA用量：10，20，40，60 ng；Taq酶種類：rTaq DNA 聚合酶，SpeedStar HS Taq DNA 聚合酶，Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶，Transfast Taq DNA 聚合酶；不同PCR儀：S1000型PCR 儀 （Bio-rad公司），ETC811型PCR儀（東勝興業(yè)科學儀器有限公司），對PCR 反應穩(wěn)定性的影響。

2.4 PCR產物檢測 在PCR 擴增產物中加入 2 μL 100 × SYBR Green Ⅰ，并于365 nm 紫外波長下進行檢測，出現綠色熒光為陽性擴增產物。

3 結果與分析

3.1 模板DNA提取質量 由于堿裂解法提取的 DNA 無法通過凝膠電泳檢測[13]，本文使用通用引物進行擴增，以檢測所獲得 DNA 質量。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，利用mcb398，mcb869引物，正品哈蟆油藥材及其混淆品均獲得約 500 bp 大小的擴增產物，見圖 1，表明提取的DNA 可以滿足PCR 反應的要求。

3.2 鑒別引物的設計及驗證 按照2.2設計的2對位點特異性鑒別引物中，155S-F/155S-R的PCR擴增特異性較698S-F/698S-R引物好，故本研究選取155S-F/155S-R作為哈蟆油及其偽品的鑒別引物，結果見圖2。

3.3 快速PCR反應條件的確定 在位點特異性PCR引物設計中人為的引入了錯配位點，因此要求

嚴格的反應條件，兼顧快速PCR的擴增效率，本文采用兩步法，30個循環(huán)進行PCR反應條件的優(yōu)化。在此基礎上依次對退火溫度、循環(huán)數、變性溫度、變性時間、退火時間、引物用量、dNTP用量、模板用量進行考察。結果顯示：①在退火溫度60～64 ℃，哈蟆油擴增條帶隨溫度的升高逐漸減弱，在62 ℃時目的條帶亮度較強，混偽品未檢出條帶，熒光檢測結果與電泳結果一致，故本研究選擇62 ℃作為退火延伸溫度。②當循環(huán)數≥30時，哈蟆油樣品可以得到目的條帶，但是循環(huán)數為30時，熒光檢測結果不明顯，兼顧擴增產量與反應時間，故本文選擇32次循環(huán)。③當變性溫度≥88 ℃時，可以得到目的條帶，隨著變性溫度的降低，PCR成功率隨著降低，但是88 ℃時條帶弱，故選擇90 ℃作為變性溫度。④變性時間為3 s 時仍然可以進行有效擴增，故選擇3 s作為變性時間。⑤退火延伸時間對擴增成功率有著重要影響，退火時間超過18 s時才能獲得有效的擴增，因此次選擇20 s為退火時間。⑥當引物終濃度在0.1～0.25 μmol·L^-1時，哈蟆油樣品有目的條帶，但是隨著引物用量的提高，正品與混偽品的熒光檢測結果區(qū)別越不明顯，這可能是生成了引物二聚體，影響到熒光檢測結果，故本文選擇其用量為0.1 μmol·L^-1。⑦當dNTP終濃度為125 μmol·L^-1時，能夠擴增出明亮的條帶，隨著其用量的增加條帶逐漸變弱，因此將其用量定為125 μmol·L^-1，引物和dNTP用量均不宜太高，這與學者報道相符[14]。⑧當模板用量10～60 ng時，均只有哈蟆油樣品擴增出單一的目的條帶，熒光檢測結果與電泳結果一致。

綜合以上優(yōu)化結果，確定哈蟆油快速PCR鑒別方法為：PCR反應體系為20 μL：2.0 μL 10×buffer，1.0 μL dNTPs（2.5 mmol·L^-1），0.2 μL 上游及下游引物（10 μmol ·L^-1），0.1 μL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，1 μL（約20 ng）模板 DNA，無菌雙蒸水補足至20 μL。PCR反應參數為90 ℃ 3 s，62 ℃ 20 s，32 個循環(huán)。

采用以上反應條件分別使用4種快速DNA聚合酶，其中SpeedStar HS Taq DNA 聚合酶，Phanta Max Super-Fidelity DNA 聚合酶均能實現對哈蟆油的真?zhèn)舞b別，rTaq DNA 聚合酶、Transfast Taq DNA 聚合酶未能得到有效擴增。使用不同廠家型號的PCR儀對哈蟆油及同屬近緣種樣品進行快速 PCR擴增，結果表明：S1000型PCR 儀 （Bio-rad公司），ETC811型PCR儀（東勝興業(yè)科學儀器有限公司），電泳檢測后均可獲得樣品的特異性目的條帶，反應條件優(yōu)化見表3。

3.4 快速PCR反應的熒光檢測 選擇優(yōu)化的哈蟆油快速 PCR反應參數，對不同產地的哈蟆油及其混偽品樣品進行快速 PCR 擴增，在擴增產物中加入 2 μL 100 × SYBR Green Ⅰ，于 365 nm 紫外波長下進行熒光檢測。結果表明，哈蟆油樣品均顯示出明亮綠色熒光，而偽品不發(fā)出熒光，取6 μL PCR產物進行凝膠電泳檢測，哈蟆油正品均擴增出目的條帶，混偽品均無條帶，見圖3。

4 討論

動物藥材作為中藥材的重要組成部分，被廣泛應用于臨床，具有療效確切、經濟價值高等特點，對其進行準確鑒定至關重要。傳統(tǒng)的性狀、理化鑒別需要經驗豐富的專業(yè)人員，且動物藥鑒定和分類學的專業(yè)人員較少，難免存在主觀性強、重復性和穩(wěn)定性差等缺陷等問題[15]。隨著分子生物學的發(fā)展，分子鑒定技術已成為中藥材傳統(tǒng)鑒別方法的有益補充。

有關哈蟆油的PCR鑒別方法已有報道，但是由于哈蟆油藥材本身遇水膨脹，給哈蟆油的DNA提取帶來一定的困難，提取過程復雜，成功率低，已建立的PCR方法操作復雜，耗時長，這些因素制約了該方法的深入應用。堿裂解法適用于中藥材DNA的快速提取，需要樣品量少，提取試劑簡單，操作簡便，5 min即可完成DNA提取，快速PCR技術可以在確保PCR反應靈敏度和特異性的前提下盡可能縮短PCR時間、提高檢測效率[16]。采用堿裂解法進行DNA提取，快速PCR進行哈蟆油鑒別較經典PCR鑒別方法具有準確、快速、簡便等優(yōu)勢。

本項研究采用堿裂解法成功提取各樣品的基因組DNA，但DNA純度不高，為了得到滿足于后續(xù)試驗要求的模板DNA，本研究使用Chelex-100對堿裂解提取得到DNA進行了純化，提高了DNA純度與PCR擴增效率，為后續(xù)快速PCR方法的建立奠定了基礎。通過對位點特異性 PCR 進行條件優(yōu)化，結合DNA快速提取與熒光檢測技術，建立了一種哈蟆油的快速PCR檢測方法，實現了在 40 min 內簡單、快速、直觀的鑒別哈蟆油及其常見混偽品的目的。該方法對鑒別人員的專業(yè)及儀器要求不高，實用性強，有助于實現哈蟆油藥材現場、準確、快速鑒定的推廣與應用。本研究對哈蟆油最常見的4種蛙類混偽品進行了鑒別研究，對于哈蟆油非蛙類的偽品如：鱈魚精巢及瓊脂蛋白胨、馬鈴薯加工品沒有涉及，因此本研究所建立方法對非蛙類偽品的適用性有待于進一步研究。

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[責任編輯 呂冬梅]