曹 睿 趙 邑 潘薇薇 曹鵬程 梁雅麗 謝海軍

（山西省生物研究所 山西太原 030000）

0 引言

Autotaxin（ATX）蛋白1992年首次在人的黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058中發(fā)現(xiàn)［1］，是一種自分泌活性因子，是分子量為126-kDa的糖蛋白。能夠以溶血磷脂酰膽堿（1ysophosphatidyIcholine，LPC）為底物催化生成溶血磷脂酸（1ysophosphatidic acid，LPA），表現(xiàn)出磷酸二酯酶活性，被歸為磷酸二酯酶家族（ENPP2 家族）［2］。除了磷酸二酯酶活性外，Autotaxin蛋白還同時(shí)具有焦磷酸酶和 ATP酶活性［3］。Autotaxin在腫瘤細(xì)胞中對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，特別是腫瘤的遷移起著重要作用，其抑制劑的開發(fā)并被認(rèn)為可能為治療腫瘤提供方法［4］。在Autotaxin蛋白的催化結(jié)構(gòu)域中一些氨基酸的糖基化至關(guān)重要，已有研究表明Asn524的糖基化對(duì)于Autotaxin蛋白發(fā)揮活性是必需的。例如：在脂肪細(xì)胞中，Asn53和Asn410的N端糖基化對(duì)于Autotaxin的分泌和活性很重要［4-5］。因此研究Autotaxin蛋白的磷酸化、糖基化等催化位點(diǎn)非常重要，可以采取生物信息學(xué)手段完成預(yù)測(cè)工作，為進(jìn)一步挖掘其生物學(xué)意義提供理論基礎(chǔ)和研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人Autotaxin蛋白fasta格式數(shù)據(jù)來自NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫，全長 915 aa，GenBank號(hào)為：AAA64785.1。

1.2 方法 Autotaxin蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析分別利用軟件 DISPHOS 1.3［6］、PhosphoSitePlus［7］、KinasePhos［8］、Scansite［9］、NetPhosk［10］、Musite［11］進(jìn) 行預(yù)測(cè)，這些軟件是現(xiàn)今比較常用的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件。

Autotaxin（ATX）蛋白的糖基化位點(diǎn)（N-型、O-型）分別用 NetNGlyc1.0［12］、Uniprot數(shù)據(jù)庫、NetOGlyc4.0［13］、YinOYang［14］1.2 軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。 各數(shù)據(jù)庫軟件參數(shù)如無特別說明均取默認(rèn)值（表1）。

表1 預(yù)測(cè)工具軟件簡(jiǎn)介

2 結(jié)果與分析

2.1 磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果 6款軟件預(yù)測(cè)的所有磷酸化位點(diǎn)中，有4款軟件同時(shí)預(yù)測(cè)到的位點(diǎn)有 2個(gè)，分別是：S-330，T-328；有 3款軟件同時(shí)預(yù)測(cè)到的位點(diǎn)有3個(gè)，分別是：S-860，S-861，T-333；有2款軟件同時(shí)預(yù)測(cè)到的位點(diǎn)有12個(gè)，分別是：S-58，S-302，S-308，S-326，S-327，S-729，S-741，S-865，T-210，T-288，T-83，T-368（表 2）。

6款預(yù)測(cè)軟件中，DISPHOS 1.3預(yù)測(cè)的全部結(jié)果均與其他軟件預(yù)測(cè)結(jié)果重合，其次，預(yù)測(cè)重復(fù)率較 高 的 軟 件 有 ：Scansite、Musite、PhosphoSitePlus。預(yù)測(cè)結(jié)果最多的為NetPhosk，KinasePhos預(yù)測(cè)結(jié)果中重復(fù)預(yù)測(cè)率較低。NetPhosk是這6款軟件中預(yù)測(cè)位點(diǎn)最多的，共有Ser修飾位點(diǎn)26個(gè)，Thr修飾位點(diǎn)13個(gè)，Tyr修飾位點(diǎn)10個(gè)。Musite軟件預(yù)測(cè)的位點(diǎn)最少，Ser修飾位點(diǎn) 3個(gè)，Thr修飾位點(diǎn) 1個(gè)，Tyr修飾位點(diǎn)1個(gè)。

表2 Autotaxin蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果分析可知，絲氨酸（Ser）修飾位點(diǎn)較多，被重復(fù)預(yù)測(cè)到的有11個(gè)位點(diǎn)；其次是蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr），被重復(fù)預(yù)測(cè)到的位點(diǎn)均為3個(gè)。此外，Scansite還預(yù)測(cè)到脯氨酸（Pro354、Pro735）及亮氨酸（Leu498）修飾位點(diǎn)。

2.2 糖基化位點(diǎn)分析結(jié)果 N型糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)通過Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢及NetNGlyc1.0軟件預(yù)測(cè)，重復(fù)被預(yù)測(cè)到的位點(diǎn)為N-54。

O型糖基化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)通過NetOGlyc4.0、YinOYang1.2軟件進(jìn)行，重復(fù)被預(yù)測(cè)到的位點(diǎn)為O-695、O-696、O-712。

3 討論

蛋白質(zhì)翻譯后修飾對(duì)細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制起重要作用，它能影響蛋白的多種屬性，包括蛋白質(zhì)折疊、活性及最終功能［15］。蛋白質(zhì)的磷酸化和糖基化的過程為：蛋白質(zhì)在蛋白激酶催化下將磷酸集團(tuán)由ATP轉(zhuǎn)移到目標(biāo)蛋白質(zhì)上，將低聚糖轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)骨架上，主要的生物學(xué)功能有：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性調(diào)節(jié)、新陳代謝、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性與溶解度，抗原性、蛋白質(zhì)靶標(biāo)、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用等［16］。真核生物磷酸化位點(diǎn)一般有絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。其中，絲氨酸和蘇氨酸是最常見的磷酸化位點(diǎn)［17］，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)末端含有羥基，羥基很活潑，可以與磷酸基團(tuán)結(jié)合。所以說，蛋白質(zhì)中如果某個(gè)絲氨酸很保守的話，很大程度上就是磷酸化位點(diǎn)。

本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)Autotaxin蛋白進(jìn)行磷酸化和糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。大部分生物信息學(xué)軟件的設(shè)計(jì)思路是基于已有數(shù)據(jù)的匯集，結(jié)合數(shù)學(xué)模型的設(shè)計(jì)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的集成開發(fā)而成。已有實(shí)驗(yàn)或文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的提供可使預(yù)測(cè)結(jié)果具有可靠性高、可重復(fù)性強(qiáng)、可驗(yàn)證性高的優(yōu)勢(shì)，缺點(diǎn)是較少提供新的數(shù)據(jù)集，科學(xué)合理的數(shù)學(xué)模型和訓(xùn)練集可彌補(bǔ)此缺陷。

本研究磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)中使用到的軟件，大部分利用的是隱馬爾科夫模型（DISPHOS 1.3、KinasePhos）［18-19］，NetPhosk 則采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法［20］，Musite采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法。從軟件本身預(yù)測(cè)結(jié)果及被其他軟件重復(fù)預(yù)測(cè)到的比例看，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確 率 排 序 為 ：DISPHOS 1.3、Scansite、Musite、Net-Phosk、PhosphoSitePlus、KinasePhos。 從重復(fù)被預(yù)測(cè)到的結(jié)果看，12個(gè)位點(diǎn)中有 5個(gè)位點(diǎn)（Y-83、T-210、T-288、S-302、S-308）是文獻(xiàn)中有明確報(bào)道為磷酸化位點(diǎn)的。不同的數(shù)學(xué)模型、算法對(duì)于預(yù)測(cè)結(jié)果的影響是較為顯著的。因此，在初步篩選數(shù)據(jù)集階段，應(yīng)該嘗試多軟件、換參數(shù)等方式，達(dá)到數(shù)據(jù)集盡可能精確、可驗(yàn)證的目的。為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供重要的依據(jù)和基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

識(shí)別蛋白質(zhì)修飾的傳統(tǒng)方法中質(zhì)譜、磷酸鹽標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)手段能檢測(cè)的修飾活性位點(diǎn)十分有限，費(fèi)時(shí)費(fèi)財(cái)，產(chǎn)出較慢。本項(xiàng)目采用高效、可靠的生物信息學(xué)手段，對(duì)Autotaxin蛋白質(zhì)修飾活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)，為其抑制劑的開發(fā)提供潛在靶點(diǎn)。