張曉波陳鑫源焦 雷 劉 毅肖 霞伊法爾·艾合買江 迪麗達(dá)爾·庫德熱提 孫玉萍

（1新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院 新疆烏魯木齊 830011 2新疆醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 新疆烏魯木齊 830011 3新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 新疆烏魯木齊 830011）

新疆氣候類型為暖溫帶大陸性極干旱氣候，庫姆塔格沙漠位于塔里木盆地的東部，自然條件惡劣，氣候極端且干旱，屬于明顯的極端干旱多風(fēng)氣候，這里白天高溫、低濕，夜晚溫度低，是典型的極端環(huán)境，這里必然生存著一些極端微生物種群，且尚處于未開墾階段，因此，這將可能是發(fā)現(xiàn)新的具有特殊功能微生物資源的寶藏。庫姆塔格沙漠地區(qū)干旱、高溫、輻射程度高，不適宜生物生長(zhǎng)，若分離得到能耐干旱高溫和耐輻射的微生物，對(duì)今后研究沙漠環(huán)境微生物的生態(tài)作用，開發(fā)極端微生物資源，改善環(huán)境都具有一定的意義，同時(shí)這些耐高溫、耐輻射微生物還可以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥衛(wèi)生實(shí)踐中。本研究目的是從庫姆塔格沙漠干燥炎熱極端沙漠土壤中分離培養(yǎng)、馴化和鑒定耐高溫耐紫外線微生物，為后續(xù)耐熱和輻射機(jī)制研究提供基礎(chǔ)資料并為耐高熱、耐輻射菌株的功能研究提供菌株資源儲(chǔ)備。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和保存 實(shí)驗(yàn)樣品為沙漠土壤樣品，采集自新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番盆地鄯善縣庫木塔格沙漠（北緯 24°50′11″，東經(jīng) 90°12′30″，海拔 440 m），取樣深度約 10 cm，取樣約 500 g，樣品存放無菌瓶中，4℃保存。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 LB牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，LB肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，均購自青島日水生物技術(shù)有限公司。

1.3 干旱沙漠土壤耐高溫耐輻射菌的馴化培養(yǎng)

1.3.1 確定稀釋涂布的合適稀釋梯度范圍 將加有適量玻璃珠和90 mL生理鹽水的250 mL三角瓶滅菌，稱取10．0 g土壤樣品于錐形瓶中，震蕩制成稀釋度為10-1的土壤樣品懸液，從懸液中吸取1 mL于裝有9 mL生理鹽水的試管中，震蕩均勻，得10-2的稀釋液。依照此方法，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-76 個(gè)稀釋度的溶液，取 100 μL涂平板，分別紫外照射 2 min、5 min、10 min，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，于50℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察平板上單菌落生長(zhǎng)情況，直至單茵落數(shù)量不再增加。確定紫外照射5 min的10-4、10-52個(gè)稀釋度的單菌落生長(zhǎng)數(shù)量情況較為理想。

1.3.2 稀釋涂布平板法處理樣品 樣品的稀釋處理步驟如 1.3.1所示，進(jìn)行 10-3、10-4、10-53個(gè)稀釋度稀釋，將3個(gè)稀釋度各做3個(gè)重復(fù)涂布，紫外燈照射5 min，于50℃ 恒溫倒置培養(yǎng)2~3 d。觀察單菌落數(shù)量變化。

1.3.3 菌株的純化和觀察 挑取稀釋涂布平板上的單菌落，進(jìn)行分區(qū)劃線純化，純化3次以后，挑取平板上的單菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察（內(nèi)容包括菌落顏色、形狀、光澤度、潮濕度、凸起或凹陷等立體形態(tài)、是否透明、邊緣是否整齊等）。利用LB培養(yǎng)基平板劃線純化菌株。純化好的菌株，利用革蘭氏染色，并于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體（染色后顏色、形態(tài)）。利用LB肉湯培養(yǎng)基已純化菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，放入4℃冰箱內(nèi)保藏。

1.4 耐高溫耐輻射菌基因組DNA提取及16S rDNA片段PCR擴(kuò)增 用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組總DNA，并以其為模板，采用細(xì)菌通用引物 Eubac 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 Eubac 1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)純菌的 16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增［13］。 PCR 反應(yīng)體系為:模板 10×PCR buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L） 4 μL、模板 2 μL、Taq DNA 聚合酶 1 μL、引物各 1 μL，補(bǔ)充去離子水至 50 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 50 s、55℃ 50 s、72℃ 50 s、33個(gè)循環(huán)、72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，NCBI Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab）網(wǎng)站數(shù)據(jù)比較已知序列，鑒定已純化菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株形態(tài)學(xué)觀察 高溫輻射（50℃，紫外照射5 min）條件下培養(yǎng)共得到形態(tài)染色不同的耐高溫、耐輻射的9菌株，形態(tài)描述見表1。

表1 分離培養(yǎng)獲得耐高溫耐輻射菌株的形態(tài)描述

2.2 沙漠土壤中耐高溫耐輻射菌16S rDNA測(cè)序及比對(duì) 對(duì)純化的9株菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序并比對(duì)，共獲得4株純菌，均屬于芽孢桿菌，與最相似菌株相似度高達(dá)100%，見表2。

表2 沙漠土壤中耐高溫耐輻射菌16S rDNA比對(duì)結(jié)果

2.3 沙漠土壤中耐高溫耐輻射菌系統(tǒng)發(fā)育分析 用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。

圖1 鄰接法構(gòu)建的沙漠土壤中耐高溫耐輻射菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

極端環(huán)境是指大多數(shù)生物無法生存的，存在某些特有的物理化學(xué)條件，例如高溫、低濕、高酸、高堿、高鹽、高壓及高輻射的環(huán)境，生活在極端環(huán)境中的微生物群體即被稱為極端微生物（Extremophils）［1-2］。 極端微生物的研究因其具有重大科學(xué)意義和廣泛應(yīng)用價(jià)值而得到了飛速發(fā)展［3－4］。極端環(huán)境的特殊理化因素形成了特殊的微生物種類及代謝途徑，這些微生物能夠?qū)垢邷?、高壓、高輻射等不利環(huán)境并產(chǎn)生特殊的生物物質(zhì)［5］。耐輻射微生物具有對(duì)電離輻射、UV輻射、DNA誘變劑和干燥環(huán)境的極端抗性，在多種自然環(huán)境中都能夠發(fā)現(xiàn)和分離耐輻射微生物，尤其在干旱及高輻射環(huán)境中發(fā)現(xiàn)較多［6］。例如耐輻射奇球菌（Deinococcus radioduransR1）在1956年首次由美國(guó)科學(xué)家Oregon等從輻射滅菌后變質(zhì)的肉類罐頭中分離出來，對(duì)電離輻射、紫外線和其他DNA損傷劑具有極強(qiáng)抗性，是迄今為止地球最耐輻射損傷的生物之一，其他例如 Rubrobacter、Acinetobacter、Chroococcidiopsis、Hymenobacter、Kineococcus、Kocuria、Methylobacterium和Thermococcus菌屬中也有發(fā)現(xiàn)耐輻射細(xì)菌的報(bào)道［7］。這些耐輻射菌株除了具有UV和γ射線及許多DNA誘變劑具有一定抗性，還對(duì)干燥和過氧化物等有較強(qiáng)的抗性，文獻(xiàn)報(bào)道一些耐輻射菌還具有吸附重金屬離子和降解芳烴類物質(zhì)的特性［8］。開發(fā)和研究這類微生物菌種資源，不僅對(duì)闡明DNA損傷修復(fù)分子機(jī)理，而且在環(huán)境保護(hù)和生物修復(fù)、人類健康，乃至地外空間的開發(fā)和利用等方面有著十分重要的意義［9－10］。

新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番盆地鄯善縣庫木塔格沙漠是典型的極端環(huán)境，干旱、高溫、晝夜溫差大等惡劣的環(huán)境條件并不適合大多數(shù)的微生物生長(zhǎng)。本研究采集該地區(qū)北緯 24°50′11″，東經(jīng) 90°12′30″，海拔440 m的土壤，采樣地點(diǎn)鮮有人類活動(dòng)，因此可以不考慮人為因素對(duì)樣品中微生物的影響。我國(guó)其他主要沙漠的土壤微生物生物量平均數(shù)量級(jí)約為106［11-12］，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)庫姆塔格沙漠土壤微生物生物量數(shù)量級(jí)在105左右，相對(duì)其他地區(qū)微生物數(shù)量較少，分析原因可能是因?yàn)閹炷舅裆衬寥牢⑸锏臄?shù)量本來就不豐富，此外，在培養(yǎng)過程中，紫外線照射可能殺死了一部分微生物，因此該沙漠樣品微生物生物量偏小。

本研究通過分離培養(yǎng)獲得的細(xì)菌并經(jīng)過高溫和高輻射馴化獲得到的耐輻射、耐高溫細(xì)菌，經(jīng)過序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)他們分屬于枯草芽胞桿菌枯草亞種（Bacillus subtilis subsp.subtilis）、地芽胞桿菌屬（Geobacillussp.）、芽胞桿菌屬（Bacillussp.）和熱噬淀粉（Bacillus thermoamylovorans），其中優(yōu)勢(shì)菌屬為Bacillus（91.91%），可見芽孢桿菌屬是庫木塔格沙漠土壤微生物群落中的優(yōu)勢(shì)屬，2013年許璐等在對(duì)庫木塔格沙漠微生物多樣性的調(diào)查中也認(rèn)為芽孢桿菌屬是庫木塔格沙漠的優(yōu)勢(shì)菌［13］，在其他沙漠微生物調(diào)查中，芽孢桿菌屬在我國(guó)其他沙漠地區(qū)也被分離得到，如塔克拉姆干沙漠和毛烏素沙漠沙地分離出了大量芽孢桿菌屬的菌株。芽孢桿菌屬革蘭氏陽性的大桿菌（約4~10 μm），嚴(yán)格需氧或兼性厭氧的有莢膜的桿菌。該屬細(xì)菌的重要特性是具有較好的抗逆性，能夠產(chǎn)生耐高溫、耐干旱及抗紫外線的內(nèi)生孢子，能夠耐受高溫、輻射、干旱，使其能更好地適應(yīng)沙漠環(huán)境，在自然界中分布廣泛。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了芽孢桿菌屬是新疆干旱沙漠土壤環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌群；馴化獲得5種耐熱和耐輻射菌，不僅在今后沙漠環(huán)境微生物的研究中具有一定的參考意義，并為今后對(duì)其功能研究?jī)?chǔ)備菌種和微生物資源。此次分離菌株種類較為單一且數(shù)量較少，可能原因?yàn)椋?）沙漠環(huán)境較為極端，微生物分布的種類和數(shù)量本身較少；2）本實(shí)驗(yàn)所使用培養(yǎng)方法針對(duì)性不高，無法完全培養(yǎng)沙漠環(huán)境全部微生物。