馬維文，張躍華，孫 紅，王俊杰＊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草原工作站，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020）

白三葉新品系無菌苗培養(yǎng)及愈傷組織誘導(dǎo)

馬維文1，張躍華1，孫 紅2，王俊杰1＊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院，呼和浩特 010019；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草原工作站，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020）

采用多因素區(qū)組試驗(yàn)方法，以白三葉新品系種子為材料對(duì)白三葉新品系無菌苗培養(yǎng)過程中消毒方法、培養(yǎng)基配方進(jìn)行研究，以培育的無菌苗為材料對(duì)不同植物生長調(diào)節(jié)劑和不同外植體對(duì)白三葉新品系愈傷組織誘導(dǎo)的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明：采用70%酒精消毒3min＋2%NaClO消毒10min，種子消毒效果最佳且對(duì)種子毒害作用最小，且在添加1.5%蔗糖的MS培養(yǎng)基上最適合無菌苗培養(yǎng)；白三葉新品系的莖較易脫分化，以莖為外植體進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，最佳培養(yǎng)基為MS＋2ug·L－16－BA＋3ug·L－12，4D，以葉為外植體進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，最佳培養(yǎng)基為MS＋0.5ug·L－16－BA＋1ug·L－12，4D。

白三葉新品系；無菌苗；愈傷組織

白三葉（Trifolium repens L.），屬于豆科（Leguminosae）車軸草屬（TrifoHum）植物，又名白花三葉草、白車軸草、白三草、車軸草、荷蘭翅搖等。白車軸草，原產(chǎn)于歐洲，目前已在世界溫帶、亞熱帶地區(qū)非常廣泛地種植。在我國云南、湖南、貴州內(nèi)蒙古等地都有野生種分布。白三葉作為一種地被植物，不僅能夠覆蓋地面，而且具有有固氮、提高土壤氮素水平的能力。白三葉草適口性好，牛羊喜食，所含營養(yǎng)成分較高，且有助于動(dòng)物消化，動(dòng)物食用曬干物質(zhì)后的消化率可達(dá)到80%，在飼用和經(jīng)濟(jì)方面具有較高價(jià)值和發(fā)展空間〔1〕。為選育適宜內(nèi)蒙古種植的白三葉新品種，通過多年試驗(yàn)，建立了白三葉新品系。本試驗(yàn)以白三葉新品系為材料，進(jìn)行了最優(yōu)無菌苗的消毒方法和消毒劑篩選以及無菌苗培養(yǎng)基篩選研究，同時(shí)優(yōu)化了白三葉無菌苗培養(yǎng)體系，以期為建立白三葉新品系組織培養(yǎng)再生體系、分子育種及抗病性研究等提供試驗(yàn)操作的基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究采用內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)系選育的白三葉（Trifolium repens L.）新品系的種子培育無菌苗。新品系植株特征：多年生草本莖匍匐，多節(jié)，無毛，主根較短，側(cè)根和不定根生長茂盛，葉互生、三出復(fù)葉，小葉倒卵形至倒心形、抗寒性強(qiáng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌苗適宜消度方法的篩選

挑選成熟度好、大小均勻的白三葉新品系種子，砂紙打磨5～10min破除種子硬實(shí)，分成18組，每組50粒。消毒之前，用細(xì)紗布包裹種子，蒸餾水沖洗約20min后，用70%酒精分別浸泡1min、2min、3min，用無菌水沖洗5～6次，滅菌濾紙吸干種子表面殘留液體。再分別用0.1%HgCl2和2%NaClO溶液浸泡白三葉種子2min、8min、12min；5min、10min、15min，期間要不斷震蕩，使其充分接觸種皮表面。無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干種子表面。置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。共18個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10粒種子。置于光照培養(yǎng)架上，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、霉菌率。

表1 種子消毒步驟及水平設(shè)置

1.2.2 無菌苗的最適培養(yǎng)基篩選

在100mL三角瓶中加入不同成分培養(yǎng)基50mL左右，瓊脂含量0.6%，pH5.8～6。以MS，1／2MS，1／4MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加0%、1.5%、3%蔗糖濃度，為篩選無菌苗最適宜的培養(yǎng)基，采用二因素隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)，共計(jì)9個(gè)處理，8次重復(fù)，每次重復(fù)10粒。置于光照培養(yǎng)架上，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、霉菌率。

1.2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)無菌苗外植體莖、葉出愈率的影響

使用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)出的無菌苗的根、莖、葉為外植體（生長30d），置于不同的培養(yǎng)基中，其中培養(yǎng)基中的6－BA濃度（0.5ug·L－1、1ug·L－1、2ug·L－1、3ug·L－1）2，4－D濃度（1ug·L－1、2ug·L－1、3ug·L－1、5ug·L－1），比較不同外植體的愈傷情況，統(tǒng)計(jì)出愈數(shù)。采用二因素隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)，共計(jì)16個(gè)處理，6次重復(fù)，每次重復(fù)5粒。置于光照培養(yǎng)架上，統(tǒng)計(jì)出愈率。

1.2.4 數(shù)據(jù)計(jì)算和處理

采用EXCEL2007和SAS9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析。相關(guān)指標(biāo)的計(jì)算公式為：

發(fā)芽率（%）＝30天內(nèi)正常發(fā)芽的種子粒數(shù)／供試種子粒數(shù)×100%

霉?fàn)€率（%）＝30天內(nèi)霉?fàn)€種子粒數(shù)／供試種子粒數(shù)×100%

愈傷出愈率（%）＝30天內(nèi)出愈塊數(shù)／植入外植體總數(shù)×100%

2 結(jié)果分析

2.1 不同消毒方法對(duì)白三葉新品系種子萌發(fā)的影響

2.1.1 70%酒精和2%NaClO消毒對(duì)白三葉新品系種子萌發(fā)的影響

種子霉菌率和發(fā)芽率可以反映出消毒效果是否理想。兩因素方差分析結(jié)果顯示，70%酒精和2%NaClO不同消毒時(shí)間對(duì)白三葉新品系種子萌發(fā)具有顯著影響作用（表2）。但是導(dǎo)致種子萌發(fā)率差異性的來源首先是70%酒精的消毒時(shí)間變化，其次是70%酒精和2%NaClO的共同作用，最后是2%NaClO消毒時(shí)間的變化。通過對(duì)9個(gè)處理組合進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，K1、K3、K8處理下種子萌發(fā)率較高，且3個(gè)處理之間無顯著性差異（P＞0.05），但是K1處理下種子發(fā)霉率最高達(dá)40%，K3和K8的發(fā)霉率均為0（表3）。因此白三葉新品系無菌苗培養(yǎng)中采用70%酒精消毒1min＋2%NaClO消毒15min或70%酒精消毒3min＋2%NaClO消毒10min效果較好。

表2 70%酒精和2%NaClO消毒時(shí)間對(duì)白三葉新品系種子萌發(fā)的影響

表3 70%酒精和2%NaClO消毒不同消毒時(shí)間對(duì)白三葉新品系種子萌發(fā)的影響

2.1.2 70%酒精和0.1%HgCl2對(duì)白三葉新品系種子萌發(fā)的影響

對(duì)白三葉種子用70%酒精和0.1%HgCl2進(jìn)行消毒，9個(gè)處理下種子發(fā)霉率均為0。兩因素方差分析結(jié)果顯示，70%酒精和0.1%HgCl2不同消毒時(shí)間對(duì)白三葉新品系種子萌發(fā)具有顯著影響作用（表4）。但是導(dǎo)致種子萌發(fā)率差異性的來源首先是70%酒精的消毒時(shí)間變化，其次是70%酒精和0.1%HgCl2的共同作用，最后是0.1%HgCl2消毒時(shí)間的變化。對(duì)9個(gè)處理組合進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，L1、L4、L7、L9處理下種子萌發(fā)率較高，且4個(gè)處理之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異（P＞0.05），但是L9處理下種子萌發(fā)率最高達(dá)44%（表5）。

表4 70%酒精和0.1%HgCl2消毒時(shí)間對(duì)白三葉新品系種子萌發(fā)的影響

表5 70%酒精和0.1%HgCl2不同消毒時(shí)間對(duì)白三葉新品系種子萌發(fā)的影響

綜合以上兩種消毒方法，70%酒精＋0.1% HgCl2消毒法霉變率低，消毒效果較好，但是種子萌發(fā)率較低，70%酒精＋2%NaClO總體上種子萌發(fā)率和霉變率較高，但是采用70%酒精消毒1min＋2%NaClO消毒15min或70%酒精消毒3min＋2%NaClO消毒10min種子在不發(fā)霉的狀況下，萌發(fā)率可達(dá)50%以上。

2.2 不同培養(yǎng)基成分對(duì)白三葉新品系無菌苗生長的影響

將白三葉種子培養(yǎng)在基本培養(yǎng)基（MS，1／2MS，1／4MS）和蔗糖濃度（0%、1.5%、3%）9種不同配比的培養(yǎng)基上，出苗率差異顯著（P＜0.05）。兩因素方差分析結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)基濃度和蔗糖濃度對(duì)白三葉新品系出苗具有顯著影響作用（表6）。但是導(dǎo)致種子萌發(fā)率差異性的來源首先是蔗糖濃度變化，其次是基本培養(yǎng)基和蔗糖濃度的共同作用，最后是基本培養(yǎng)基濃度的變化。對(duì)9個(gè)處理組合進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示（表7），P2處理下出苗率最高且顯著高于其他處理（P＜0.05），P3和P5培養(yǎng)基的出苗率次之，蔗糖濃度為0的培養(yǎng)基上白三葉新品系出苗率均最低，表明在培養(yǎng)基上添加適量濃度蔗糖利于植株生長。綜上所述，白三葉新品系無菌苗培養(yǎng)最適培養(yǎng)基為MS＋1.5%蔗糖。

表6 不同培養(yǎng)基和蔗糖濃度對(duì)白三葉新品系出苗的影響

表7 不同培養(yǎng)基和蔗糖濃度下白三葉新品系出苗率情況

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)白三葉新品系外植體莖和葉出愈率的影響

適宜配比的細(xì)胞分裂素和生長素能夠促進(jìn)外植體脫分化形成愈傷組織，進(jìn)而再次分化呈新植株。采用含有不同濃度的細(xì)胞分裂素6－BA和生長激素2，4－D對(duì)白三葉新品系的莖和葉進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。

兩因素方差分析結(jié)果顯示（表8），6－BA濃度和2，4－D濃度變化對(duì)白三葉新品系莖出愈率影響顯著（P＜0.05）。出愈率的差異性首先來自于6－BA濃度變化，其次為6－BA和2，4D濃度的交互作用，2，4D濃度變化對(duì)差異貢獻(xiàn)最小，2，4D對(duì)莖愈傷的影響較小。

表8 6－BA濃度和2，4－D濃度對(duì)白三葉新品系莖出愈率的影響

兩因素方差分析結(jié)果顯示（表8），6－BA濃度和2，4－D濃度變化對(duì)白三葉新品系葉的出愈率影響顯著（P＜0.05）。出愈率的差異性首先來自于6－BA濃度變化，其次為6－BA和2，4D濃度的交互作用，最后為2，4D濃度變化，但2，4D濃度變化對(duì)葉愈傷的影響亦較大。

表9 6－BA濃度和2，4－D濃度對(duì)白三葉新品系葉出愈率的影響

對(duì)16種不同培養(yǎng)基配比下白三葉新品系莖和葉的出愈率進(jìn)行方差分析（表10），白三葉新品系莖的愈傷能力整體高于葉的愈傷能力。C11培養(yǎng)基上莖的出愈率最高達(dá)到94.3%，顯著高于其他處理（P＜0.05），C1、C4、C8次之，愈傷率在80%以上。C1培養(yǎng)基上葉的出愈率最高達(dá)90.0%，顯著高于其他處理（P＜0.05），C7次之，愈傷率為53.3%以上，其他處理出愈率均較低。因此，白三葉新品系以莖為外植體進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，最佳培養(yǎng)基為MS＋2ug·L－16－BA＋3ug·L－12，4D；以葉為外植體進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)，最佳培養(yǎng)基為MS＋0.5ug·L－16－BA＋1ug·L－12，4D。

表10 不同培養(yǎng)基無菌苗莖和葉片為外植體的出愈率

3 討論與結(jié)論

3.1 消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響

無論與NaClO還是HgCl2配合消毒，酒精消毒時(shí)間的變化都是導(dǎo)致白三葉新品系種子萌發(fā)率差異性的主要貢獻(xiàn)因素，可見酒精的消毒作用占很大比重，但是單純使用酒精并不能使種子完全達(dá)到無菌條件。有研究表明消毒劑在殺滅微生物的同時(shí)傷害外植體〔2〕。邢少辰等〔3〕研究表明，升汞和次氯酸納處理使浸泡的栽培大豆（Glycine max）發(fā)芽率極低。使用2%NaClO溶液對(duì)白三葉新品系種子消毒不徹底，有霉菌現(xiàn)象出現(xiàn)，使用0.1% HgCl2雖能有效控制污染，但影響了白三葉新品系的發(fā)芽率，有的平均發(fā)芽率低至2%，可見HgCl2對(duì)白三葉種子造成的毒害作用較強(qiáng)。吳志剛等〔4〕發(fā)現(xiàn)單純使用NaClO溶液處理番茄（Lycopersicon esculentum.）種子消毒不徹底，將近20%有污染，0.1%HgCl2雖然能有效控制污染，但毒害嚴(yán)重，僅有8%的種子發(fā)芽率，與本研究結(jié)果相似。NaClO消毒常用濃度2～5%，厚彥明等〔5〕用9%高濃度NaClO溶液中震蕩25min，作為岷山紅三葉種子的消毒方法，但未對(duì)其消毒效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。綜合消毒效果及毒害效果，在培養(yǎng)白三葉新品系無菌苗過程中，采用70%酒精消毒3min后2%Na－ClO消毒10min進(jìn)行種子消毒，效果最佳。

3.2 不同培養(yǎng)基和不同外植體類型對(duì)愈傷的影響

在不同6－BA濃度和2，4D濃度的培養(yǎng)基上，白三葉新品系莖的整體愈傷率較葉高，表明莖的分化程度較低，容易脫分化，愈傷能力較高。在莖的脫分化過程中6－BA的作用較大，2，4D主要起調(diào)節(jié)作用。在葉脫分化過程中6－BA和2，4D共同作用，因此二者的合理配比能夠促進(jìn)白三葉新品系葉脫分化形成愈傷組織。

〔1〕馬毓泉.內(nèi)蒙古植物志：第3卷〔M〕.呼和浩特：內(nèi)蒙古人民出版社，1985.

〔2〕高雪芹，王俊杰，云錦鳳，侯永霞，賈文秀.紅三葉新品系無菌苗培養(yǎng)體系優(yōu)化〔J〕.草地學(xué)報(bào)，2010，（06）：880－883＋896.

〔3〕邢少辰，林秀峰，莊炳昌.大豆無菌苗的獲得〔J〕.吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，（02）：7－9.

〔4〕吳志剛，宋明，王志敏，牛義.番茄組織培養(yǎng)中無菌苗培養(yǎng)條件的優(yōu)化〔J〕.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，（04）：335－337.

〔5〕厚彥明，師尚禮，杜文華，等.岷山紅三葉愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生研究〔J〕.草地學(xué)報(bào)，2008，16（4）：359－363.

［＊通訊作者］王俊杰，男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，教授，主要從事藥用植物與牧草種質(zhì)資源與育種研究，E－mail：jjw62＠163.com

Sterile Seedling Culture and Callus Induction of New Hybrid Trifolium repens L.

Ma Weiwen1，Zhang Yuehua1，Sun hong2，Wang Junjie1
（1.College of Grassland，Resources and Environment，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot，Inner Mongolia Autonomous Region 010019，China；2.Inner Mongolia grassland workstation，Hohhot in Inner Mongolia010020，China）

With multifactor block test method，disinfection methods for seed，medium formula for sterile seedlings and callus of new hybrid Trifolium repens L.were researched，the results showed that using 70%alcoholfor 3minutes and 2%NaClO for 10minutes were the best seed disinfection method and had the least toxic to the seed.The most suitable medium for sterile seedling culture was MS supplemented with 1.5%sucrose.The stem of new hybrid Trifolium repens L.was more easier to be dedifferentiated，and the best callus induction medium for stem was MS＋2ug·L－16－BA＋3ug·L－12，4D，the best callus induction medium for leaf was MS＋0.5 ug·L－16－BA＋1ug·L－12，4D.

new hybrid Trifolium repens L.；sterile seedlings；callus

S336

A

2095—5952（2017）02—0043—06

2017－03－10

國家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD13B07）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃課題（2016YFC0500605）

馬維文（1990－），女，河北張北縣人，碩士研究生，主要從事牧草種質(zhì)資源與育種研究，E－mail：mwxl90＠163.com。